Q:PANF跟PAN有什么區(qū)別？
A：PANF001（fast），屬于長(zhǎng)臂疏水柱，按照工業(yè)級(jí)流速要求做的設(shè)計(jì)，效率高、流速快、耐受性更強(qiáng)，同時(shí)顏色更藍(lán)一些。
Q：流速過(guò)快一次過(guò)柱能結(jié)合嗎？
A：如果您是科研級(jí)的純化實(shí)驗(yàn)，因?yàn)橹恿魉俑撸缘陀?0cm的重力柱容易出現(xiàn)接觸不完全的情況，建議二次上樣（即將樣品過(guò)柱后的穿出物，再次過(guò)柱，確保蛋白與柱料充分結(jié)合）。
Q：洗脫咪唑濃度200mM洗脫不下來(lái)
A：說(shuō)明書(shū)中洗脫咪唑濃度建議200mM ,新工藝鎳柱，掛的鎳與蛋白的抓附能力太強(qiáng)，結(jié)合力特別好，常規(guī)蛋白我們建議500mM咪唑就可以洗脫,而一些蛋白和鎳柱的結(jié)合力比較強(qiáng)的話(huà)，可能在用500mM洗脫時(shí)效果不太理想，建議把洗脫咪唑濃度調(diào)整成1M，或者是2M。如果用戶(hù)能夠在實(shí)驗(yàn)前針對(duì)洗脫咪唑濃度做一個(gè)梯度摸索，肯定是能達(dá)到一個(gè)最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。
Q：柱子上面的墊片實(shí)驗(yàn)前是否要取出？
A：不用取出。
Q：如何配置破菌緩沖液：
A：1 L 體積
Tris 20 mM (6M HCl調(diào)pH值到7.4) 2.42 g
NaCl 250 mM 14.6 g
PMSF 1 mM 10 mL 100X 儲(chǔ)液
100X PMSF 儲(chǔ)液(1.74 g PMSF 溶解于100 mL異丙醇), -20℃長(zhǎng)期保存，4℃保存數(shù)月，禁止室溫存放
Q：如何配置上樣緩沖液：
A：同破菌緩沖液，可以不加PMSF
Q：如何配置洗雜緩沖液：
A：在上樣緩沖液中添加咪唑至20 mM，洗雜咪唑濃度建議20mM-40mM
Q：如何配置洗脫緩沖液：
A：在上樣緩沖液中添加咪唑至200 mM，新工藝鎳柱，掛的鎳與蛋白的抓附能力太強(qiáng)，結(jié)合力特別好，常規(guī)蛋白我們建議500mM咪唑就可以洗脫,而一些蛋白和鎳柱的結(jié)合力比較強(qiáng)的話(huà)，可能在用500mM洗脫時(shí)效果不太理想，建議把洗脫咪唑濃度調(diào)整成1M，或者是2M。如果用戶(hù)能夠在實(shí)驗(yàn)前針對(duì)洗脫咪唑濃度做一個(gè)梯度摸索，肯定是能達(dá)到一個(gè)最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。
Q：目的蛋白不同，緩沖液一樣的配方？
A：目的蛋白質(zhì)不同，可能需要不同的純化緩沖液。具體使用可以參考分子克隆等工具書(shū)或者文獻(xiàn)對(duì)緩沖液做修改。也可以根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)對(duì)上述緩沖液做修改
Q：凍融如何做，反復(fù)凍融幾次：
A：從-80°拿出來(lái)，再放進(jìn)去反復(fù)凍融至少3次
Q：目的蛋白質(zhì)在PH7.4下不穩(wěn)定：
A：可以在pH7.3-8.3的范圍內(nèi)對(duì)緩沖液的pH調(diào)整
Q：洗雜蛋白時(shí)目的蛋白質(zhì)也洗脫：
A：加5%甘油，0.1% tritonX100，0.5M NaCl可能會(huì)有效果，起到以下兩個(gè)作用：
（1）減少非特異吸附：甘油，去垢劑（triton），NaCl 都可以減少蛋白間疏水作用降低非特異吸附， 使雜蛋白更容易洗脫；
（2）通過(guò)減少蛋白間疏水作用使HIS-tag暴露的更加靈活，與Ni結(jié)合的更緊密，不容易被洗脫。
還有一種方法即洗雜緩沖液中咪唑濃度降低或者不添加。
Q：如何再提高蛋白質(zhì)純化的效果：
A：一些情況下，緩沖液中添加5%-10%的甘油，0.1%的tween，0.5M的NaCl會(huì)提高蛋白質(zhì)純化的效果。
Q：破菌時(shí)可以用EDTA做蛋白酶抑制劑嗎
A：可以適當(dāng)加入PMSF作為蛋白酶抑制劑，但是不能使用EDTA。
Q：破菌時(shí)可以用DTT做還原劑嗎
A：還原劑使用2 mM 2-ME，避免使用DTT，因?yàn)镈TT會(huì)造成Ni/Co離子還原
Q：破菌緩沖液可以用PBS嗎
A：可以
Q：我購(gòu)買(mǎi)的是1ml預(yù)裝柱，十倍柱體積平衡是多少量？
A：10ml上樣緩沖液
Q：一個(gè)過(guò)程下來(lái)需要多長(zhǎng)時(shí)間？正常流速每秒多少滴
A：重力柱，一般1s流速50ul左右
機(jī)械柱可以?xún)x器調(diào)節(jié)，一般跟重力柱比可以快50-100%
Q：如果流速過(guò)慢，怎么處理
A：可以使用硅膠管控制上樣速度?；蝾A(yù)裝柱下面接軟管，再接蠕動(dòng)泵
Q：正常流速過(guò)一次柱就可以充分結(jié)合了嗎？是否需要多過(guò)幾次柱？
A：一次就可以，如果您是科研級(jí)的純化實(shí)驗(yàn)，因?yàn)橹恿魉俑?，所以低?0cm的重力柱容易出現(xiàn)接觸不完全的情況，建議二次上樣（即將樣品過(guò)柱后的穿出物，再次過(guò)柱，確保蛋白與柱料充分結(jié)合）。
Q：上樣完成后，是否可直接進(jìn)入洗雜步驟
A：樣品上完以后，使用上樣緩沖液洗柱10個(gè)柱體積，注意將純化柱側(cè)壁上的殘留樣品洗干凈。
Q：如何洗去雜蛋白
A：使用10-20倍柱體積洗雜緩沖液將雜蛋白從純化柱上洗去，如果雜蛋白太多可以加大洗雜體積。
Q：如何判定洗雜步驟已經(jīng)完成
A： 一般10個(gè)柱體積即為洗雜步驟完成。
Q：雜帶多，雜蛋白洗不掉怎么辦
A：增加咪唑濃度，若仍無(wú)好轉(zhuǎn)，嘗試下：洗雜液中添加NaCl到150mM【Nacl濃度最高不要超過(guò)500mM】，TritonX100到1%【作用去掉柱料的一些非特異性吸附】，甘油到5%
Q：如何洗脫目的蛋白
A：洗雜結(jié)束以后，使用4-10倍柱體積洗脫緩沖液將目標(biāo)蛋白洗脫。通常目標(biāo)蛋白會(huì)在第二個(gè)柱體積中開(kāi)始流出。
Q：難以洗脫目的蛋白
A：難以洗脫的蛋白最高可用咪唑濃度2M，或者EDTA連同鎳離子一起洗脫（不得已的辦法）。
Q：如何判斷收集的液體中有目的蛋白
A：收集液中的目的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE檢測(cè)。
Q：純化完成后如何處理柱子/保存柱子
A：收集完成以后，使用8M尿素或者6M鹽酸胍5倍柱體積洗柱，再使用大量蒸餾水水洗柱，封閉純化管上下兩端保存在4 ℃，不要在-20 ℃凍結(jié)。如果長(zhǎng)期不用，加入5 ml 20%乙醇封閉保存。
Q：哪些情況下需要鎳柱重生
A：His?Bind Resin可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子純化不同目標(biāo)蛋白，或者長(zhǎng)時(shí)間使用造成金屬離子脫落，柱子堵塞、流速慢，可以按照下述方法進(jìn)行再生。
Q：如何重生
A：1. 用0.1 M EDTA洗柱4倍柱體積，將金屬離子洗脫下來(lái)，再用蒸餾水洗柱10倍柱體積除去EDTA殘留。
2. 使用0.2 M醋酸洗柱4倍柱體積，10倍柱體積蒸餾水沖洗，再用0.1M 氫氧化鈉洗柱4倍柱體積， PBS/TBS平衡pH，大量蒸餾水洗柱。這一步需要避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿洗柱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
3. 用4%氯化鎳或者硫酸鎳3倍柱體積重新螯合10分鐘，也可以使用4%氯化鈷或者硫酸鈷螯合柱子。
4. 柱子長(zhǎng)時(shí)間不用，加入20% 乙醇，封口后于4攝氏度保存，避免干裂或者凍結(jié)。
Q：可以重復(fù)用多少次
A：10-20次
Q：重生后效果如何？與初始狀態(tài)相比可以達(dá)到多少?
A：至少95%
Q：堵柱嚴(yán)重，怎么辦
A：如果柱子堵塞嚴(yán)重，重生時(shí)使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。
Q：螯合鎳時(shí)間太長(zhǎng)，有時(shí)一天，是否會(huì)影響效果
A：沒(méi)有影響
Q：使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)堵塞嚴(yán)重，且流速越來(lái)越慢
A：樣品處理過(guò)程中，高速離心，最好用0.45um的濾膜過(guò)濾（推薦）
如果柱子堵塞嚴(yán)重，重生時(shí)使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。
流速慢，可再柱子下面接一根軟管。
Q：如何保存
A：20%乙醇保存；4℃保存，3年有效。
Q：是否必須冰上操作？常溫是否可以？
A：在未知Ni-NTA His?Bind Resin融合蛋白穩(wěn)定性的情況下，整個(gè)純化過(guò)程最好在4℃完成
Q：是否可以用EDTA
A：可以使用蛋白酶抑制劑防止降解，但是EDTA應(yīng)當(dāng)在純化完成以后再加入。
Q：是否可以使用非離子去垢劑改善結(jié)合？具體濃度？
A：可以，具體使用濃度參考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，0.03% SDS，0.1% NP-40。
Q：購(gòu)買(mǎi)的1ml預(yù)裝柱可以結(jié)合多少蛋白
A：每根1 ml的His?Bind Resin親和柱一次可以結(jié)合大約20 -30 mg His-tag融合蛋白
Q：我們的樣品種類(lèi)較多，可以用同一根柱子嗎
A：最好不同的融合蛋白使用不同的柱子，樣品較多，可以使用多根柱子，或者純化完一種樣本后需重生后再純化另外一種蛋白。
Q：有哪些方法可以減少雜蛋白的結(jié)合
A：上樣緩沖液中可以含有1 mM咪唑減少雜蛋白的結(jié)合
Q：我的目的蛋白在咪唑20mM時(shí)就掉下來(lái)了
A：部分目標(biāo)蛋白會(huì)在20 mM咪唑洗雜緩沖液中流出，所以對(duì)于新樣品，每一步都要留樣電泳，摸索純化條件。
Q：我的目的蛋白是包涵體形式，如何變性
A：如果融合蛋白是包涵體形式，那么可以選擇變性純化方法，通常是在緩沖液中加入8M 尿素以及去垢劑。變性純化時(shí)一定要做好樣品處理，不然容易造成柱子堵塞。
Q：變性后的蛋白如何處理
A：變性方法得到的蛋白一般沒(méi)有活力，可以用來(lái)制備抗體，但如想測(cè)定活力，就需要做復(fù)性。
Q：變性蛋白如何復(fù)性
A：蛋白質(zhì)復(fù)性方法有很多種，稀釋法、透析法、離子交換復(fù)性法，分子篩復(fù)性法，自己選擇合適的方法來(lái)做。
Q：除了可以咪唑洗脫，還有其他方法可以洗脫嗎
A：除了常規(guī)的咪唑洗脫方法以外，還有EDTA洗脫和pH梯度洗脫。后兩種方法缺點(diǎn)明顯，只在特殊情況下使用。
Q：去除his 標(biāo)簽的方法
A：可以使用在柱酶切的方法得到去除His-tag的目標(biāo)蛋白。經(jīng)常使用的酶包括：Thrombin；Enterokinase；TEV protease等。我們推薦TEV protease（貨號(hào)：RPP002），因?yàn)檫@種酶的特異性較好，是帶有Ni-NTA His?Bind Resin的重組酶，方便除去。在柱酶切可以提高產(chǎn)物純度，但是空間位阻可能造成酶切效果不好，按照慣例，多數(shù)實(shí)驗(yàn)不用切除Ni-NTA His?Bind Resin。
Q：金屬離子脫落，柱子失去顏色或者變色
A：確證破菌緩沖液中不含有EDTA、EGTA、檸檬酸、DTT等螯合劑；重新處理柱子，為His-Binding-resin螯合金屬離子。
Q：融合蛋白是包涵體
A：降低表達(dá)溫度（16-22℃），降低IPTG誘導(dǎo)濃度（10-100 μM），縮短誘導(dǎo)時(shí)間（2-5小時(shí)）；做包涵體復(fù)性，或者使用變性純化。
Q：表達(dá)量太低
A：換載體或者優(yōu)化密碼子序列。
Q：融合蛋白不結(jié)合
A：測(cè)序檢查核酸序列，將tag從一端移到另一端，增加接頭序列。
Q：融合蛋白被蛋白酶降解
A：在破菌緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，縮短純化時(shí)間，降低溫度。
Q：融合蛋白不能從柱子上洗脫
A：加入0.1% TritonX-100；增加NaCl濃度；使用變性純化。
Q：融合蛋白被蛋白酶降解
A：在破菌緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，縮短純化時(shí)間，降低溫度。
Q：有些宿主細(xì)胞的分子伴侶蛋白會(huì)與融合蛋白結(jié)合
A：上樣前加入5 mM DTT，或者使用10 mM MgSO4 50 mM Tris，2 mM ATP先反應(yīng)20分鐘，讓伴侶蛋白去結(jié)合。
Q：超聲裂菌過(guò)度，目標(biāo)蛋白被打斷
A：注意超聲儀的工作功率以及超聲時(shí)間，使用顯微鏡控制裂菌。
Q：金屬離子親和柱非常容易產(chǎn)生非特異性吸附，特別是在目標(biāo)蛋白表達(dá)量較低時(shí)
A：在上樣緩沖液中加入去垢劑，可以有多種選擇；加大目標(biāo)蛋白上樣量；減少bead使用量；加大鹽離子濃度；咪唑梯度洗脫；變性純化等等。
Q：PMSF是否可以不加
A：PMSF為蛋白酶抑制劑，作用是防止目的蛋白被降解，可以不加
Q：破菌液中加咪唑嗎
A：可以不加，如一定要加，建議可以加1-5mM，加了會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，減少雜蛋白的結(jié)合，增加雜蛋白的穿出
Q：重復(fù)使用，效率不高，怎么辦
A：在第一次使用后，處理一下“8mol 尿素 沖洗（1ml鎳柱對(duì)應(yīng)20ml尿素），用水沖洗干凈尿素，上0.1mol 硫酸鎳 （1ml鎳柱對(duì)應(yīng)1ml硫酸鎳）”，然后再進(jìn)行后面的操作
Q：結(jié)合不到蛋白或結(jié)合力弱
A：1. Binding buffer(或者細(xì)胞裂解buffer)
咪唑濃度不要超過(guò)5mM，NTA和HIS-Tag的結(jié)合力較弱所以最好不加咪唑，先把蛋白binding上去再洗雜蛋白；
PH中性或偏堿（PH 7.0-8.5）酸性條件下蛋白很難和鎳柱結(jié)合；
buffer中不要有EDTA(可以螯合鎳)，DTT等還原劑（可以還原鎳）。
2. 蛋白特性
蛋白折疊后his-tag被包裹在內(nèi)部，無(wú)法暴露出來(lái)與鎳柱結(jié)合； 可以嘗試在蛋白中加入變性劑尿素（2M-8M）在部分或完全變性 的條件下純化蛋白。
Q：不掛柱
A：不掛柱的情況比較常見(jiàn)，一般先從蛋白樣本找原因，建議重新構(gòu)建克隆試下。
Q：來(lái)源于哪些表達(dá)系統(tǒng)的His蛋白有很好的純化效果（原核？真核？例如桿狀病毒/哺乳細(xì)胞/酵母/細(xì)菌等）
A：只要目的蛋白質(zhì)帶His標(biāo)簽都可以用鎳柱純化，注意分泌表達(dá)的蛋白質(zhì)，如果培養(yǎng)基中含有復(fù)雜的成分，其中可能含有還原劑或螯合劑，此時(shí)培養(yǎng)基上清不能直接用鎳柱純化，應(yīng)當(dāng)先將培養(yǎng)基脫鹽處理再上柱純化。
Q：蛋白量少，推薦用多大規(guī)格的預(yù)裝柱
A：正常20mg/ml的載量，推薦小規(guī)格預(yù)裝柱
Q：上清渾濁，是用IDA好還是NTA好
A：上清渾濁，推薦適當(dāng)稀釋上清，并在此離心或者過(guò)0.45um濾膜處理。IDA或NTA都可純化。
Q：如何自己裝柱（重力柱）
A：參考裝柱說(shuō)明，詳詢(xún)請(qǐng)咨詢(xún)技術(shù)人員
Q：預(yù)裝柱純化過(guò)程中，流速越來(lái)越慢，除了加硅膠管，還有什么方法
A：推薦再生柱料。
Q：我在純化時(shí)變性緩沖液里加入巰基乙醇，對(duì)鎳柱是否有影響？如果不用巰基乙醇會(huì)有什么影響？
A：不加是沒(méi)有影響的，不過(guò)有些蛋白可能會(huì)出現(xiàn)沉淀的情況，這個(gè)要看蛋白特性來(lái)看的。巰基乙醇濃度不要超過(guò)30mM，或者5mM DTT
Q：如果表達(dá)蛋白中含有半胱氨酸沒(méi)有二硫鍵，在純化時(shí)是否需要加還原劑保護(hù)，一般用多大濃度
A：可以不加還原劑，不加還原劑可能會(huì)有20%-30%二硫鍵。如果要全部游離狀態(tài)的話(huà)，可以加1mM DTT
Q：純化率達(dá)到多少？
A：大部分蛋白可達(dá)到95%以上，特殊蛋白情況不定，尤其是包涵體蛋白，可能達(dá)不到95%
Q：生物酶是否可以用鎳柱純化
A：可以
Q：洗雜蛋白時(shí)，咪唑加到40mM，目的蛋白就會(huì)掉下來(lái)，20-30mM雜蛋白又總洗不掉，反復(fù)做了幾次，始終收不到想要的蛋白，請(qǐng)問(wèn)有什么建議嗎？
A：20mM洗雜蛋白，洗雜緩沖液中添加NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 50mM洗脫目的蛋白質(zhì)。
Q：1ml可以加多少蛋白液（菌液）？
A：根據(jù)表達(dá)的蛋白質(zhì)的量來(lái)決定上樣體積。
Q：融合蛋白鎳柱純化有雜帶，目標(biāo)蛋白量不算小，但雜帶很明顯。排除目的蛋白被降解的可能。
A：緩沖液中NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 來(lái)降低非特異性結(jié)合。
Q：柱子中有大氣泡，且排不出去。
A：手工重力柱 裝柱時(shí) 有時(shí)里面會(huì)有小氣泡 對(duì)于流速和純化都不會(huì)有影響
如果影響到了流速和純化效果的話(huà)，可以加3/4柱體積的 20%乙醇 然后用1ml槍頭將上面的篩片撥動(dòng) 重新裝一下上面的篩片即可
Q：包涵體蛋白，尿素變性后怎么做
A：1. 破菌離心收集包涵體沉淀。
2. 包涵體沉淀用含1%的Triton-100，超聲重懸。再離心收集沉淀。
3. 選作，步驟2再重復(fù)一遍。
4. 包涵體沉淀用6M （如果6M不溶，補(bǔ)加尿素到8M）重溶，短暫超聲可以輔助包涵體溶解。
5. 離心，去掉不溶的沉淀。
6. 配置復(fù)性緩沖液：含5mM GSH，0.5mM GSSG，10%甘油的PBS或者TBS
7. 復(fù)性緩沖液預(yù)冷到0-4℃，電磁攪拌旋轉(zhuǎn)下，將6M尿素中的變性蛋白，慢慢滴加到復(fù)性緩沖液中。按照1體積的變性蛋白質(zhì)，20-100體積的復(fù)性緩沖液的體積比稀釋。
8. 繼續(xù)攪拌1小時(shí)。
9. 選作，4℃靜置過(guò)夜。
10. 選作，離心去除未變性的蛋白質(zhì)。如果純重力上樣，推薦做此步，防止柱子堵塞不流。
11. 復(fù)性蛋白質(zhì)上NTA-鎳柱純化。
若做的是包涵體蛋白，推薦用NTA-鎳柱（變性液可以直接過(guò)柱），不可用IDA-鎳柱，復(fù)性后蛋白會(huì)破壞IDA鎳柱
Q：要用鎳柱做實(shí)驗(yàn)，樣品大于55kd，為包涵體，原核表達(dá)的？
A：可以用6M鹽酸胍變性，然后用帶8M尿素的緩沖液（鎳柱純化全程）
樣品用6M脲變性溶解后，緩沖液也是相同條件，然后用咪唑梯度洗脫即可。
8M脲有點(diǎn)高了，而且不好溶解；6M胍溶液太稠了，溶液流的太慢了（如果用機(jī)器，壓力就會(huì)太大）。
Q：1.原核表達(dá)蛋白時(shí)如何增加目的蛋白表達(dá)量？乳糖取代IPTG效果是否明顯？2.若目的蛋白為包涵體，如何增加最后復(fù)性得率？是先復(fù)性？還是先純化？3.目的蛋白易降解，在表達(dá)、純化和儲(chǔ)存方面需要注意事項(xiàng)
A：1. 原核表達(dá)蛋白質(zhì)增加蛋白量需要摸索條件，乳糖替代IPTG誘導(dǎo)有時(shí)候表達(dá)量增加有時(shí)候減少。一般規(guī)律是如果不容易降解的重組蛋白質(zhì)增加誘導(dǎo)時(shí)間會(huì)增加表達(dá)量，容易降解不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)需要摸索一個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成蛋白質(zhì)降解，表達(dá)量降低。
2. 包涵體復(fù)性液需要摸索不同的復(fù)性方法和復(fù)性緩沖液。一般推薦先復(fù)性再純化。
3. 目的蛋白質(zhì)容易降解，一般需要降低表達(dá)時(shí)候的溫度，摸索一個(gè)合適的誘導(dǎo)時(shí)間，純化時(shí)在低溫條件下進(jìn)行，純化時(shí)間要快，盡量誘導(dǎo)結(jié)束，盡快收菌、破菌、上柱純化。純化后的蛋白質(zhì)保存嘗試DTT、甘油等保護(hù)劑，在-80℃保存。
Q：上樣后剛開(kāi)始慢慢滴，沒(méi)一會(huì)就不滴了，是否可以用洗耳球加壓，控制1s一滴，會(huì)不會(huì)太快。
A：這個(gè)情況是正常的，可以用洗耳球，但是這樣做工作量太大，太累了。建議：
1. 12000rpm 離心10min，如果還是比較渾濁，再離心一次。
2.或者0.45um濾膜過(guò)濾一下。
Q：蛋白裂解液粘稠該如何處理
A：裂解液粘稠是流不下來(lái)的，建議①在超聲儀上做超聲，打斷核酸，裂解液會(huì)變清亮不粘稠,若是包涵體蛋白，達(dá)不到清亮但不會(huì)粘稠②反復(fù)凍融，有好轉(zhuǎn)，效果沒(méi)做超聲好③加入全能核酸酶
Q：第一遍過(guò)柱速度慢，不接軟管的情況下可以如何調(diào)整加快流速。
A：樣品稀釋?zhuān)档驼吵矶取?
Q：最后一步用8M尿素或鹽酸胍洗柱是否一定要做，加尿素的作用是什么？
A：不是必須步驟，但若不洗，后續(xù)純化會(huì)有雜蛋白。加尿素可以使蛋白變性，非特異性結(jié)合的蛋白洗下來(lái)。
Q：如何洗去咪唑
A：用水大量沖洗
Q：顏色很淡，會(huì)不會(huì)影響效果？需要重新螯合Ni嗎
A：不影響效果，不用重新螯合。
Q：鎳柱顆粒大小是多少
A：65-160um
Q：未能純化到His標(biāo)簽蛋白？
A：建議先確認(rèn)是否為蛋白沒(méi)有掛柱直接流穿？還是蛋白未被洗脫下來(lái)？若排除這兩點(diǎn)，我們還總結(jié)了以下因素，建議您一一排除：
1、Q：超聲功率不對(duì)
A：超聲前加入溶菌酶，改變超聲功率
2、Q：樣品或者結(jié)合緩沖液不對(duì)
A：檢測(cè)PH及樣品盒結(jié)合緩沖液的組成份。保證溶液中的螯合劑或強(qiáng)還原劑濃度及咪唑的濃度不高。
3、Q：組氨酸的標(biāo)簽沒(méi)有完全的
A：在變性條件下（用4-8M脲，或4-6M鹽酸胍）進(jìn)行純化
4、Q：His標(biāo)簽丟失
A：建議1、檢查His是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變His標(biāo)簽的位置（C-terminal or N-terminal)，必要時(shí)增加His個(gè)數(shù)（常用6-10個(gè)）
建議2、降低流速、增加孵育時(shí)間
建議3、尋找最佳的結(jié)合金屬離子
Ni2+通常是宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)6個(gè)組氨酸標(biāo)記重組蛋白的一般常用金屬離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受長(zhǎng)度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類(lèi)型、以及緩沖液的PH這幾種因素影響，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不同Ni2+。
Q：目的蛋白洗脫不下來(lái)
1、Q：洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）
A：增加咪唑的梯度或降低PH來(lái)找出最佳的洗脫條件。
2、Q：若您選用降低PH的方法洗脫的，PH低于3.5，會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落
A：改變洗脫方法，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫
3、Q：蛋白已沉淀在柱上
A：減少上樣量，或使用咪唑的線(xiàn)性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCL的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8M脲，或4-6M鹽酸胍）。
4、Q：非特異性疏水或其他相互反應(yīng)
A：洗脫緩沖液中添加非離子去污劑（如2%Triton X-100）或增加NaCL的濃度。
Q：洗脫后雜帶較多，什么原因？如何優(yōu)化？很多天然的蛋白也會(huì)帶有HIS，所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶
1、Q：蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白
A：請(qǐng)?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?。（慎用EDTA）
2、Q：雜質(zhì)對(duì)鎳離子有更高的親和性
A：推薦1：優(yōu)化咪唑濃度，以確保宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合和組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合之間的最佳平衡。分步或線(xiàn)性洗脫摸出最優(yōu)的咪唑結(jié)合和清洗濃度；在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20個(gè)或更多的柱床體積），可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白。
推薦2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCL濃度，PH的范圍都需要進(jìn)行篩選。
Q：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合
A：在超聲前加入還原劑或去垢劑；增加去垢劑的濃度，（2%Triton X-100 or2% Tween 20)；或者在washing buffer中增加甘油的濃度（50%）減少非特異性的相互反應(yīng)?？紤]增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。
Q：洗滌不充分
A：增加洗滌的次數(shù)。
Q：蛋白過(guò)鎳柱純化的原理
A：鎳可以與有His標(biāo)簽的堿性蛋白結(jié)合。蛋白上樣后，帶有his標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，雜蛋白流出。鎳也可以與咪唑結(jié)合，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到鎳上，再用咪唑梯度洗脫，目的蛋白就被洗下來(lái)了，收集穿出液，里面就是目的蛋白，再透析掉咪唑。
Q：是否需要孵育?還是直接過(guò)柱流下來(lái)，直接結(jié)合了？
A：直接過(guò)柱流下來(lái)，鎳柱與蛋白結(jié)合很快，不需要孵育
Q:推薦的線(xiàn)性流速是多少？
A:fast flow正?？梢?cm/min，一般推薦0.5cm/min就已足夠（1ml/min）。
Q:柱子不小心干了，怎么處理？填料出現(xiàn)了結(jié)塊
A：可以用20%乙醇或PBS/TBS重懸一下即可。出現(xiàn)結(jié)塊用1ml槍吹散。
Q:蛋白表達(dá)量較低，洗完之后如何濃縮
A：超濾管濃縮
Q：CHO細(xì)胞表達(dá)的蛋白，能否用鎳柱純化
A：只要帶his標(biāo)簽就可以用鎳柱純化。但是蛋白質(zhì)樣品要預(yù)處理一下，引物cho細(xì)胞培養(yǎng)基上清組分比較復(fù)雜，可能影響掛柱。
Q：蛋白樣品如何預(yù)處理
A：各種預(yù)處理方法，比如超濾去除培養(yǎng)基中大部分氨基酸，硫酸銨沉淀，或者透析，這個(gè)是蛋白純化策略問(wèn)題，不同的樣本量，樣本形式都不一樣。
Q：我用了0.1%濃度sds和10mM巰基乙醇，不知道會(huì)不會(huì)影響過(guò)柱效果？
A：sds濃度上限0.1%，不能超過(guò)這個(gè)，如果加了sds，上柱之前一定要離心。巰基乙醇濃度上限30mM.10mM沒(méi)有問(wèn)題
Q:蛋白等電點(diǎn)在4.5左右，那么我把緩沖液ph調(diào)到4.5時(shí)能夠進(jìn)行純化嗎，ph對(duì)柱子的吸附和洗脫能力影響大嗎?
A:建議用PH6.8洗脫
Q:分泌蛋白，之前沒(méi)純化直接測(cè)了一下酶活，然后過(guò)幾天又測(cè)了一下，發(fā)現(xiàn)酶活不穩(wěn)定，我的蛋白等電點(diǎn)分別是4.15，4.78，6.42，7.61，分別用多少ph的緩沖液能在一周內(nèi)較為穩(wěn)定的保存純化液呢
A:一般在等電點(diǎn)上下1.5-2.5左右都可以，去掉強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境,6.8 ,6.8 ,8.4, 6.
Q：容易堵柱
A：充分離心后 再上樣
Q：緩沖液推薦使用的tween可以加tween-20嗎？平衡柱子的上樣緩沖液也可以放tween嗎？
A：可以
Q：純化另一種蛋白，想要用原來(lái)的空柱子填裝新的填料，怎么處理柱子
A：如果沒(méi)有嚴(yán)重污染的話(huà)，雙蒸水沖洗 75% 酒精噴下 再加就可以了
注意篩片最好超聲波里清洗下，這樣裝柱后效果更好。篩片只需要清洗，不需要高壓
Q:鎳柱能否在PH 10的情況下使用
A：常規(guī)下，我們是在弱酸或者弱堿性條件下使用，這個(gè)PH值可能會(huì)對(duì)性能有一定的影響，但是可以使用，使用后，記得進(jìn)行平衡處理，不建議長(zhǎng)期浸泡在酸堿度偏高的環(huán)境中
Q：我的蛋白是包涵體蛋白，蛋白在8M尿素條件下溶解后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)配方配置的緩沖液，洗脫后有少量目的蛋白，用8M尿素洗柱子時(shí)穿出液檢測(cè)出很多目的蛋白
A：建議緩沖液配置時(shí)8M尿素作為基礎(chǔ)條件，均加入8M尿素
Q:蛋白純化需要在超凈臺(tái)完成嗎
A:不需要
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