Q:拉到空的eGFP蛋白，出現(xiàn)非特異性吸附，怎么解決？
A：防止非特異性吸附，建議洗滌時加：加500mM Nacl、1%triton
Q：實驗后剩余的珠子沉淀下來不方便吸取，如何溶解？
A：用下游的裂解液 或者是 500mM Nacl、1% triton洗滌吹打都可以
Q：貼壁細胞如何裂解
A：取10cm細胞培養(yǎng)皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，然后加入500微升至2毫升細胞裂解液裂解細胞（如RIPA）；具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法
Q：組織樣品如何裂解
A：對于組織樣品，參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解；具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法
Q：懸浮細胞如何裂解
A：取懸浮細胞，離心收集細胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解；具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法
Q：結(jié)合能力是多少
A：1ml結(jié)合25mg蛋白（1ml protein A+G可以結(jié)合25mg human IgG）
Q：不同量的細胞，裂解方法一樣嗎
A：不同量的細胞，應選用適當裂解液的用量進行裂解
Q：裂解的是動物細胞，不是組織，是否用中等強度的RIPA
A：推薦使用sds裂解液，TNE裂解液，含有NP-40 ，EDTA，Tris等，方便好用，比RIPA溫和一些。
Q：細胞裂解液RIPA是否分強、中、弱？如果與全能核酸酶一起使用，同時加入嗎
A：ripa分強中弱，可以和全能核酸酶一起使用，但chip實驗一般用裂解能力更強的sds裂解液，（10^6細胞推薦用100ul-200ul裂解液）
Q：裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，怎么辦
A：如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋
Q：裂解獲得的蛋白樣品濃度過低，怎么辦
A：如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量
Q：蛋白樣品很粘稠，超聲后略有好轉(zhuǎn)，但雜帶很多，背景高
A：建議在細胞處理時加入全能核酸酶，以降低實驗背景，提升實驗結(jié)果的可重復性。
Q：如何去除非特異性結(jié)合
A：1. 取0.2-1mL蛋白樣品，蛋白量約為0.2-1mg，加入約1ug和免疫沉淀時使用的IgG 種屬相同的普通IgG和20uL充分重懸的Protein A+G Sepharose，4℃緩慢搖動30分鐘至2小時。
2. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。
通過和 normal IgG和Protein A+G Sepharose的孵育，可有效降低非特異性結(jié)合，減少實驗背景干擾。
Q：種屬相同的IgG是什么
A：所謂種屬相同的IgG是指，假如后續(xù)免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG可以加入其它不影響后續(xù)檢測的其它mouse IgG類型的抗體
Q：一抗加多少
A：加入0.5-2ug 用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動過夜
Q：Protein A+G懸液是否為：TBS溶液？我們的懸液是否可直接用于實驗？還是要先洗Beads？
A：不是TBS，是20%乙醇，實驗前要先用PBS洗
Q：我們的Protein AG重懸在20%乙醇中，使用前怎么處理
A：用多少取多少再處理，例如用一次，20ul用PBS沖洗后，如果做的是IP實驗，那可以直接做后續(xù)的實驗，不需要再用PBS重懸
Q：Protein A+G Sepharose每次加入多少
A：加入10-20uL充分重懸的Protein A+G Sepharose，4℃緩慢搖動1-3個小時。
☆注意：10-20uL Protein A+G Sepharose，即20-40uL50%充分重懸的Protein A+G Sepharose。
Q：一般1ug的抗體，用多少sepharose
A：1ug抗體，建議用10-20ul的sepharose（也就是20-40ul 50%重懸的溶液），我們的sepharose是保存在酒精中的，使用前要先用PBS洗的
Q：吸除上清時離心條件
A：2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時高速離心
Q：吸除上清時吸到一點Protein A+G Sepharose，有沒有影響
A：寧可殘留少量上清，也不能吸掉Protein A+G Sepharose。
Q：用什么洗滌沉淀
A：用準備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次
Q：洗滌沉淀用裂解液用量推薦多少
A：裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升
Q：洗滌時離心條件
A：洗滌時離心條件和吸除上清離心條件一樣，即：2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時高速離心
Q：離心洗滌后是否要去除上清
A：完成最后一次洗滌后，去除上清
Q：如何分離出樣品
A：加入20-50uL 1xSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，震蕩重懸沉淀，瞬時高速離心把樣品離心至管底
Q：樣品離心至管底后如何處理
A：沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳
Q：暫時不用的樣品如何保存
A：暫時不用的樣品可以-20℃保存
Q：免疫沉淀適用什么樣品
A：普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但推薦用新鮮的蛋白樣品為佳。
Q：免疫共沉淀適用什么樣品
A：免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。
Q：免疫共沉淀實驗方法
A：與免疫沉淀方法相同
Q：免疫共沉淀實驗過程中，細胞裂解時是否可以加入全能核酸酶
A：推薦在細胞裂解時加入全能核酸酶（貨號RPE002），降低背景，提升實驗的可重復性。
Q：如何保存
A：常溫運輸； 4℃保存，兩年有效。
Q：能否冷凍保存Protein A+G Sepharose
A：請勿冷凍保存產(chǎn)品
Q：未混合均勻
A：Protein A+G Sepharose Beads使用前要充分顛倒若干次，使Sepharose混合均勻
Q：能否常溫實驗
A：所有步驟中，蛋白樣品 在4℃或冰上操作
Q：可重復做多少次/是否可回收
A：可重復6-10次，避免純化不同抗體而產(chǎn)生交叉反應
同樣pull-down實驗，每次用量10-50uL，不推薦回收。如果用量大，每次0.5mL以上，可以pH2.5洗脫結(jié)合的抗體后，膠回收（用50mM NaOH洗滌，PBS沖洗后，保存在4度20%乙醇里）。
Q：所有蛋白樣品需要在4°C或冰上操作的原因？
A：避免蛋白變性
Q：在使用Protein A+G Sepharose Beads 時，怎么達到去除非特異性吸附的最佳效果？
A：可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實驗或者雖然是進行免疫共沉淀實驗，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度（0.2-0.5%）的SDS洗滌抗體-sepharose beads復合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。
Q：IP的實驗步驟中，最后都沒有將兩個蛋白質(zhì)分開的步驟，難道是在前面的步驟中相結(jié)合的兩個蛋白質(zhì)自己已經(jīng)分開了嗎？
A：上樣時要加loading buffer，煮沸。這時所有蛋白都變性，自然就分開了。也有人先將蛋白洗下來再電泳
Q：經(jīng)?？吹降鞍踪|(zhì)免疫共沉淀后行westernblot,我想問什么時候需要作免疫共沉淀？為什么不直接進行westernblot 呢？
A：通常，免疫共沉淀，是檢測可溶性蛋白的步驟之一，而不是最終的方法。因為沉淀的蛋白，還需要進行進一步的檢測。而后續(xù)的步驟大凡使用免疫印跡的方法去完成。如果做質(zhì)譜分析，一般還要進一步用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后回收。由于采用了免疫學的方法沉淀目的蛋白，使之蛋白的檢測帶有強烈的目的性。 免疫共沉淀純化蛋白的質(zhì)量，與抗體化珠子（Beads）的質(zhì)量和洗滌緩沖液的質(zhì)量及其洗滌的方法
Q：當目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過強而導致影響對目的蛋白的WB結(jié)果判斷。這該如何避免？
A：針對上述情況，通常有二種解決辦法：
1． 選擇不同種屬的抗體分別進行免疫沉淀實驗和WB實驗，這樣再選擇一個種屬交叉反應比較弱或者無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。
2． 使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A+G beads交聯(lián)，然后通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-sepharose beads復合物，最后離心去除抗體-sepharose beads復合物，上清中只留下目的蛋白。
Q：能否做染色質(zhì)（染色體）免疫共沉淀實驗
A：能
Q：是否BSA預封閉處理
A：pull-down實驗，一般不推薦BSA封閉。一般在實驗中發(fā)現(xiàn)非特異吸附現(xiàn)象很嚴重是，才考慮加入BSA。
Q：是否針對任何實驗，Protein A+G均可替代Protein A或Protein G？
A：是的
Q：A+G與A或G相比優(yōu)勢是？
A：protein a+g比protein a或protein g適合于免疫沉淀更多種類的抗體
Q：條帶淡可能原因？解決方法
A：1）最簡單方法，增加實驗樣品的量和濃度。每毫升ProteinAG可以吸附20mg以上抗體，一般pulldown實驗，proteinAG都是過量的。
2）延長proteinAG和樣品的混合震蕩時間（例如4度過夜），保證proteinAG和樣品的充分接觸。
Q：sepharose對人或鼠lgG的親和力如何
A：人的親和力是1ml結(jié)合20mg以上 IgG，鼠大概3mg左右
Q：一次性收集的細胞，大約0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）
A： IP實驗時候，推薦消化下來細胞后，直接用RIPA裂解液裂解。根據(jù)目的蛋白質(zhì)的表達位置（細胞質(zhì)、細胞核還是細胞器）可以選擇抽提細胞亞組分。選擇合適的強度的裂解液。蛋白酶抑制劑推薦用cocktail。
Q：是否需要將總蛋白用非免疫血清和Sepharose反應，去除非特異性結(jié)合蛋白，再來加抗體，接著加Sepharose？
A： 推薦用用非免疫血清preclear樣品，降低非特異性產(chǎn)生的假陽性。
Q：如果需要先處理非特異性結(jié)合蛋白，那么非免疫血清，就是陰性對照的抗體（正常鼠IgG）嗎？
A：是的。
Q：未檢測到目得蛋白或蛋白很少
A：1、提高樣品量；2、降低buffer的離子強度。
Q：目的蛋白高背景
A：蛋白質(zhì)背景高1、首先確認電泳體系、染色體系、WB體系沒有錯誤；2、提高buffer的離子輕度；3、實驗中增加preclear去掉非特異性吸附問題。
Q：能否用高濃度的變性劑
A：不推薦使用高濃度的變性劑尤其是強變性劑，容易使蛋白質(zhì)變性造成實驗失敗。
Q：如何使用對照抗體
A：對照抗體選擇同種未免疫的動物提取的血清中純化的抗體，各種亞型都有商品化產(chǎn)品。
Q：能否幾種抗體共同使用
A：幾種抗體同時使用，可以但是不推薦。
Q：單克隆抗體的作用
A：單克隆抗體的優(yōu)點是特異性高。
Q:抗體的特異性有多重要
A:特異性高的抗體能夠有效的補貨目的蛋白質(zhì)同時降低背景。
Q:蛋白間的相互作用發(fā)生在哪里
A:蛋白質(zhì)的相互作用位點需要其他實驗來證明。
本產(chǎn)品僅供科學研究使用，不得用于人體 / 動物醫(yī)療、診斷及臨床治療
