Q:cck-8是否可檢測懸浮細胞

A:可以

Q：96孔板每孔孵育多少個細胞

A：通常細胞增殖實驗每孔約2000個細胞，細胞毒性實驗每孔約5000個細胞，具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定。

Q：說明書推薦每孔2000個細胞，若我的是每孔10000個細胞，每孔加多少CCK8？

A：培養(yǎng)基和CCK-8比例10:1就可以

Q：96孔板，每孔中接種多少細胞懸液

A：100 ul /孔

Q：48孔板或24孔板是否可用

A：建議不用，48孔和24孔均不可上酶標儀檢測。推薦常規(guī)96孔板

Q：96孔板每孔加入多少CCK-8溶液

A：每孔加入10ul 7Sea-CCK-8，如果起始的培養(yǎng)體積為200ul，則需加入20ul  7Sea-CCK-8，培養(yǎng)基和CCK-8比例10:1

Q：如何做空白對照

A：可以用加相應量細胞培養(yǎng)基和7Sea-CCK-8但不加細胞的孔作為空白對照，若擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設置加相應量細胞培養(yǎng)液、藥物和7Sea-CCK-8但不加細胞的孔作為空白對照。

Q：只加CCK-8不加細胞的空白孔，數(shù)值上增

A：在整個實驗過程中，隨著時間的增加，如果細胞培養(yǎng)時間較長，請注意蒸發(fā)問題。因為反應環(huán)境溫度較高，會有部分液體揮發(fā)。空白組雖然沒有細胞，但是隨著液體的揮發(fā)，藥物濃度相當于提高了，所以空白對照的數(shù)值也會有輕微的變化（但不會有明顯的變化）。如果很在意空白對照的數(shù)值，可將96 孔板外圍一圈加培養(yǎng)基、水或PBS 保濕。同時，可以把96 孔板置于培養(yǎng)箱內靠近水盤的位置以緩解蒸發(fā)。將96孔板外圍兩圈用PBS鋪板，這樣揮發(fā)先揮發(fā)周邊的，可以對內部及空白對照的影響降至最低。

Q：加入CCK8后孵育多久

A：在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育1-4小時，具體時間可以通過預實驗確定。

Q：一般多久測一次值

A：預實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。

Q：如何測吸光值

A：用酶標儀測定在450 nm處的吸光值

Q:如果沒有450nm濾光片，可以選用其他的濾光片嗎

A:若無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片

Q:如果樣品是高渾濁度的細胞懸液，可以使用多大的波長測定

A:可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

Q:加入CCK8后暫時不測OD值，可以如何處理暫時保存？能夠保存多久？

A:如果需要暫時不測定O.D值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，避光保存在室溫，24小時內吸光度不會發(fā)生變化。

Q:CCK8結果怎么處理？有計算細胞活力的公式嗎

A:扣除背景后的數(shù)值直接表示細胞活力，如果測藥物的IC50，須用origin等軟件做曲線擬合。

Q:如何制作CCK-8標準曲線？

A:cck8沒有標準曲線，具體看實驗內容。

Q:請問CCK8測450nnM的OD值用什么時間點最好？做過1h，2.5h,4h的時間梯度，發(fā)現(xiàn)不同時間點同一樣品其吸光值不一樣而且吸光值的變化趨勢也不一樣。那么OD值在多大的范圍時比較好呢？這樣好根據(jù)吸光值的范圍確定時間點。

A:OD值在0.3-0.7范圍內做比較好

Q:如何保存

A:7Sea-Cell Counting Kit 溶液在避光、0-5℃的條件下可以保存1 年，若長期不用可在-20℃下避光保存2 年。建議分裝后保存于-20℃，使用時提前于4℃解凍，請避免反復凍融，否則增加背景值，干擾實驗結果。

Q:需要準備哪些設備及耗材

A:1. 10ul、100-200 ul 以及多通道移液器
   2. 酶標儀（帶有450 nm 濾光片）
   3. 96 孔培養(yǎng)板
   4. CO2 培養(yǎng)箱

Q:培養(yǎng)時間設定

A:培養(yǎng)時間根據(jù)細胞種類的不同和每孔內細胞數(shù)量的多少而不同。在正式實驗前，建議先做預實驗摸索鋪板的細胞數(shù)量以及加入7Sea-Cell Counting Kit 試劑后的培養(yǎng)時間。

Q:鋪板注意事項

A:鋪板時請注意保證每個孔細胞數(shù)量均勻，建議鋪板過程中注意時?；靹?，防止因細胞沉淀造成不均勻。

Q:混勻

A:加入7Sea-Cell Counting Kit后請前后左右輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次，使培養(yǎng)基和7Sea-Cell Counting Kit 溶液充分混勻。

Q:是否需要更換培養(yǎng)基

A:不需要，若藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

Q:待測物質有氧化性或還原性該做何處理

A:本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，如果待測物質有氧化性或還原性，可在加7Sea-Cell Counting Kit 之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
   可在加7Sea-CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。如果實驗中有還原劑，請檢查背景的O.D值，即在不含細胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入CCK-8試劑在一定時間內檢測，和不加藥物的培養(yǎng)基進行比較（只有CCK-8試劑），如果O.D值明顯偏高，則說明有反應。

Q:如果培養(yǎng)基顏色或PH已變化，是否需要更換新的培養(yǎng)基

A:加入7Sea-Cell Counting Kit時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

Q:酶標儀檢測前查看有無氣泡

A:用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。

Q:槍頭孔壁殘留誤差

A:用槍頭加樣后更換槍頭。加7Sea-Cell Counting Kit時可直接加入液面以下，加樣后，前后左右傾斜混合幾次，保證混合均勻

Q:適用細胞

A:因為測線粒體酶，所以真核細胞，有線粒體的均可，例如單細胞，動物細胞。但有細胞壁的細胞，例如植物細胞，酵母細胞，底物進入細胞效率低，不推薦。

Q:觀察天數(shù)

A:推薦1到2天

Q:吸光值過高

A:縮短加入試劑后的溫育時間

Q:參比波長

A:實驗驗證，絕大多數(shù)情況下，參比波長不是必須的，用空白對照作為零也可以。但是在細胞培養(yǎng)時間長，或者培養(yǎng)有懸浮物，或有其他大顆粒藥物等情況下，可以通過參比波長修正結果（每個孔里的干擾不一致，參比波長可以起到修正的作用）

Q:重復性

A:完全同樣的情況下，測量讀數(shù)批間誤差小于1%

Q:線性不佳原因

A:細胞不均；培養(yǎng)液蒸發(fā)；還原劑；氣泡；孔板周圍一圈不能用，除非只培養(yǎng)少于一天的時間；細胞數(shù)目很重要，太少信號會低

Q:分散性不好的培養(yǎng)液

A:前后左右來回傾斜96孔板，使試劑混合充分

Q:晶體析出

A:儲存時間太長；溫度過低；之前使用后關閉不嚴或體積太?。ㄕ舭l(fā)），可能會過飽和產(chǎn)生析出現(xiàn)象（低于5%的小幾率事件）?？梢栽谑覝鼗旌险鹗?，以助溶解。

Q:金屬毒性

A:可以檢測金屬毒性，最好做空白對照

Q:OD值還可以，但數(shù)值跨度太大（波動大）

A:數(shù)據(jù)跨度大須重新設計實驗。

Q:CCK8與傳統(tǒng)的MTT方法相比有哪些優(yōu)勢

A:1. 7Sea-Cell Counting Kit是用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測等與細胞活性和增殖相關的實驗的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。
  2. 7Sea-Cell Counting Kit對細胞無毒性，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高。
  3. 7Sea-Cell Counting Kit溶液不需配制，可以直接加入到細胞樣品中，即開即用，比MTT 更加穩(wěn)定，實驗結果重復性好，適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測。
  4. MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

Q:適用于那些細胞？其他還有哪些細胞可用？生物被膜內的活菌（流感嗜血桿菌和綠膿桿菌）

A:所有哺乳動物的細胞，細菌一般沒有檢測CCK8的，可以染色法，或者流式，最常規(guī)的方法，有報道， 比濁法測OD600

Q:CCK-8是定性還是定量

A:定量

Q:樣本是不敏感的T淋巴細胞

A:1、細胞鋪板10萬/well. 或者預實驗摸索一個比較合適的細胞濃度。

   2、cck8不但與細胞數(shù)量有關，還與細胞活力有關。所以T淋巴細胞雖然不增值，還是能檢測到細胞活力的，但是需要的細胞的數(shù)量需要的比較多。

   3、如果藥物處理后直接加cck8檢測，確定藥物有沒有吸收背景。

   4、實驗周期比較長，在實驗結束，重新測一下細胞密度，確認細胞數(shù)量。

Q:是否可以替代Brud或EDU法檢測細胞增殖

A:雖然CCK通過檢測對生長期的細胞內的脫氫酶來反應細胞的活性，而胸腺嘧啶插入法通過核苷酸類似物的方式插入合成的DNA來檢測細胞的活性，這幾種方法是有一定關聯(lián)性的，CCK可替換胸腺嘧啶插入法來檢測細胞增殖，并且檢測更方便

Q:懸浮細胞/貼壁細胞分別如何做實驗

A:懸浮細胞注意別在換液時候丟失細胞即可。

Q:溶解后的甲臜是在培養(yǎng)液里還是在細胞內

A:甲臢是在培養(yǎng)液中的

Q:如果OD值低，什么原因造成？可以采取什么辦法

A:OD偏低原因1、細胞活力低；2、細胞數(shù)量少，可以采取加大細胞數(shù)量或者延長孵育時間（最高可以嘗試8小時）來解決

Q:設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？

A:參比波長是為了降低細胞或者96孔板造成的誤差，可以不設

Q:CCK8試劑盒，在檢測的時候，血清和培養(yǎng)基里的酚紅對檢測結果有沒有影響

A:無影響，建議做空白對照

Q:空白孔數(shù)值偏高，有可能是培養(yǎng)基長菌嗎？或者其他原因？

A:空白孔數(shù)值偏高一般認為染菌造成的，很少出現(xiàn)這種問題

Q:CCK8能檢測組織嗎

A:不能檢測組織

Q:不是很穩(wěn)定，重復孔，同樣的處理因素，結果差異有點大，原因？

A:重復孔不穩(wěn)定主要原因是細胞分配不均勻

Q:是否可以檢測T細胞

A:可以，T細胞長的慢，需延長孵育時間

Q:CCK 對照組0.5左右和樣品組0.3左右 OD值都不高

A:建議1、孵育時間增加一倍；2、細胞數(shù)量增加（預實驗摸條件）

Q:當兩個細胞混合培養(yǎng)時（骨髓間充質細胞，另一個是懸浮T細胞），培養(yǎng)一段時間后，只測骨髓間充質干細胞的生長、增殖情況，請問用CCK-8能測嗎？怎么做？

A:通常測定細胞的生長狀況，可以有兩種方法，
   1） 對于懸浮細胞，不換液，直接在培養(yǎng)上清中，按照比例加入CCK-8, 培養(yǎng)一段時間即可，此時酚紅的干擾幾乎可以忽略不計，如果有不含細胞的孔，那么可以直接去除背景，所以問題不大。
   2）對于貼壁細胞，建議先把培養(yǎng)基和CCK-8按照比例混合，然后換液培養(yǎng)，這樣做的目的是，降低孔間加樣的差異。

對于這兩種細胞的情況，
   1）如果測定貼壁細胞的生長狀況，那么可以把懸浮的T細胞轉移掉，使用上述第二種方法測定。
   2）如果T細胞對于間充質細胞的生長很關鍵，不能取走，那么測定的活性程度是總量，此時，需要對每一個孔的T細胞進行估算，如果每個培養(yǎng)條件下T細胞總量接近，或者T細胞含量很少，遠遠小于間充質細胞，也可以測定，使用對照孔可以去除T細胞的影響。
   3）如果T細胞可以短時間內除去，可以找個靈敏度高的CCK-8，信號強，建議細胞量合適的情況下（每一個孔10000個），30分鐘左右出讀數(shù)結果，測定后，可以將T細胞再加入培養(yǎng)孔。 這樣做對細胞的生長影響不大。但是如果做動力學，那么要考慮的因素多一些。

Q:耐藥細胞與親本細胞用CCK結果無差異，是什么原因導致

A:耐藥細胞和親本細胞結果無差異是實驗設計的問題。選擇合適的藥物濃度或者直接測藥物對耐藥細胞和親本細胞的IC50

Q:應用范圍

A:生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗、藥敏試驗、腫瘤放射敏感性測定等

Q:7Sea-Cell Counting Kit是通過和細胞內的脫氫酶反應而反映著細胞數(shù)量，假如細胞已經(jīng)死亡，而脫氫酶活性還有，那么如何計算細胞數(shù)量？

A:多數(shù)情況下，細胞死亡過程中，細胞內的成分會降解，脫氫酶會有部分釋放，但是活性和活細胞比，比較低。舉例說：１００個細胞死亡２０小時后，釋放的脫氫酶活力，不足５個活細胞的脫氫酶活力，也就是說，這種情況帶來的誤差５％以內。而且，這種細胞死亡，對同種細胞來說，情況是一樣的，一般都是在不同的孔間比較同種細胞，所以系統(tǒng)誤差是一樣的，即系統(tǒng)誤差會彼此消減

Q:試劑盒中有高濃度的1Methoxy PMS的存在，那么毒性怎樣

A:無須擔心，ＰＭＳ等化學物質很穩(wěn)定，沒有揮發(fā)性；高純的的產(chǎn)品，對細胞生長是沒有影響的，而且一般測量細胞生長都在生物安全柜中進行，對人體而且非常安全。

Q:若每次測定的數(shù)值不同是什么原因？如何解決？

A:原則上， 7Sea-Cell Counting Kit在不同試驗中都可以精確反應細胞的數(shù)量。如果不同試驗產(chǎn)生偏差，可能是培養(yǎng)基的量、試劑的量有偏差，如果細胞數(shù)量一樣，讀數(shù)應該是一致的。不過，測量的讀數(shù)不一致，不重要，重要的是線性，換句話說，如果兩次試驗同樣細胞數(shù)量讀數(shù)有差異，那么這種差異對每個孔都是一致的，細胞數(shù)量5000的讀數(shù)降低了10%，那么細胞數(shù)量10000的也會降低10%。
   建議：每次試驗設定內參（陽性，陰性和標準曲線），只要標準曲線的線性是一致的，就可以對測量的數(shù)值放心。

Q:如何避免某些物質對實驗結果的影響?

A:1）設定陰性對照，每個孔的本底干擾都減去，保證減去本底后，讀數(shù)都是細胞造成的。
   2）做標準曲線，預先知道在可能的干擾物質存在情況下，影響有多大。

Q:Cell Counting Kit做藥物刺激兩個周的實驗怎么做？

A:首先要保證兩周時間，細胞數(shù)量不會超過3萬/孔； 先做一個標準曲線，確定線性范圍； 設置實驗時，要有陰性對照(無藥物）； 每個顯色的時間點要統(tǒng)一（比如都是加入CCK8后2小時讀數(shù)）； 建議每個數(shù)據(jù)點都要重復3個孔以上。

本產(chǎn)品僅供科研實驗使用，不用于臨床診斷、治療及其他非科研用途。