Q:拉到空的eGFP蛋白，出現(xiàn)非特異性吸附，怎么解決？

A：防止非特異性吸附，建議洗滌時(shí)加：加500mM Nacl、1%triton

Q：實(shí)驗(yàn)后剩余的珠子沉淀下來(lái)不方便吸取，如何溶解？

A：用下游的裂解液 或者是 500mM  Nacl、1% triton洗滌吹打都可以

Q：貼壁細(xì)胞如何裂解

A：取10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞（如RIPA）；具體的裂解方法，應(yīng)參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法

Q：組織樣品如何裂解

A：對(duì)于組織樣品，參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解；具體的裂解方法，應(yīng)參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法

Q：懸浮細(xì)胞如何裂解

A：取懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解；具體的裂解方法，應(yīng)參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法

Q：結(jié)合能力是多少

A：1ml結(jié)合25mg蛋白（1ml protein A+G可以結(jié)合25mg human IgG）

Q：不同量的細(xì)胞，裂解方法一樣嗎

A：不同量的細(xì)胞，應(yīng)選用適當(dāng)裂解液的用量進(jìn)行裂解

Q：裂解的是動(dòng)物細(xì)胞，不是組織，是否用中等強(qiáng)度的RIPA

A：推薦使用sds裂解液，TNE裂解液，含有NP-40 ，EDTA，Tris等，方便好用，比RIPA溫和一些。

Q：細(xì)胞裂解液RIPA是否分強(qiáng)、中、弱？如果與全能核酸酶一起使用，同時(shí)加入嗎

A：ripa分強(qiáng)中弱，可以和全能核酸酶一起使用，但chip實(shí)驗(yàn)一般用裂解能力更強(qiáng)的sds裂解液，（10^6細(xì)胞推薦用100ul-200ul裂解液）

Q：裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高，怎么辦

A：如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋

Q：裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)低，怎么辦

A：如果蛋白樣品濃度過(guò)低，在以后的裂解過(guò)程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量

Q：蛋白樣品很粘稠，超聲后略有好轉(zhuǎn)，但雜帶很多，背景高

A：建議在細(xì)胞處理時(shí)加入全能核酸酶，以降低實(shí)驗(yàn)背景，提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。

Q：如何去除非特異性結(jié)合

A：1. 取0.2-1mL蛋白樣品，蛋白量約為0.2-1mg，加入約1ug和免疫沉淀時(shí)使用的IgG 種屬相同的普通IgG和20uL充分重懸的Protein A+G Sepharose，4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí)。
     2. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。
     通過(guò)和 normal IgG和Protein A+G Sepharose的孵育，可有效降低非特異性結(jié)合，減少實(shí)驗(yàn)背景干擾。

Q：種屬相同的IgG是什么

A：所謂種屬相同的IgG是指，假如后續(xù)免疫沉淀時(shí)用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無(wú)normal IgG可以加入其它不影響后續(xù)檢測(cè)的其它mouse IgG類型的抗體

Q：一抗加多少

A：加入0.5-2ug 用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜

Q：Protein A+G懸液是否為：TBS溶液？我們的懸液是否可直接用于實(shí)驗(yàn)？還是要先洗Beads？

A：不是TBS，是20%乙醇，實(shí)驗(yàn)前要先用PBS洗

Q：我們的Protein AG重懸在20%乙醇中，使用前怎么處理

A：用多少取多少再處理，例如用一次，20ul用PBS沖洗后，如果做的是IP實(shí)驗(yàn)，那可以直接做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，不需要再用PBS重懸

Q：Protein A+G Sepharose每次加入多少

A：加入10-20uL充分重懸的Protein A+G Sepharose，4℃緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí)。

 ☆注意：10-20uL Protein A+G Sepharose，即20-40uL50%充分重懸的Protein A+G Sepharose。

Q：一般1ug的抗體，用多少sepharose

A：1ug抗體，建議用10-20ul的sepharose（也就是20-40ul 50%重懸的溶液），我們的sepharose是保存在酒精中的，使用前要先用PBS洗的

Q：吸除上清時(shí)離心條件

A：2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心

Q：吸除上清時(shí)吸到一點(diǎn)Protein A+G Sepharose，有沒有影響

A：寧可殘留少量上清，也不能吸掉Protein A+G Sepharose。

Q：用什么洗滌沉淀

A：用準(zhǔn)備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次

Q：洗滌沉淀用裂解液用量推薦多少

A：裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升

Q：洗滌時(shí)離心條件

A：洗滌時(shí)離心條件和吸除上清離心條件一樣，即：2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心

Q：離心洗滌后是否要去除上清

A：完成最后一次洗滌后，去除上清

Q：如何分離出樣品

A：加入20-50uL 1xSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，震蕩重懸沉淀，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底

Q：樣品離心至管底后如何處理

A：沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳

Q：暫時(shí)不用的樣品如何保存

A：暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存

Q：免疫沉淀適用什么樣品

A：普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但推薦用新鮮的蛋白樣品為佳。

Q：免疫共沉淀適用什么樣品

A：免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。

Q：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)方法

A：與免疫沉淀方法相同

Q：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞裂解時(shí)是否可以加入全能核酸酶

A：推薦在細(xì)胞裂解時(shí)加入全能核酸酶（貨號(hào)RPE002），降低背景，提升實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

Q：如何保存

A：常溫運(yùn)輸； 4℃保存，兩年有效。

Q：能否冷凍保存Protein A+G Sepharose

A：請(qǐng)勿冷凍保存產(chǎn)品

Q：未混合均勻

A：Protein A+G Sepharose Beads使用前要充分顛倒若干次，使Sepharose混合均勻

Q：能否常溫實(shí)驗(yàn)

A：所有步驟中，蛋白樣品 在4℃或冰上操作

Q：可重復(fù)做多少次/是否可回收

A：可重復(fù)6-10次，避免純化不同抗體而產(chǎn)生交叉反應(yīng)
    同樣pull-down實(shí)驗(yàn)，每次用量10-50uL，不推薦回收。如果用量大，每次0.5mL以上，可以pH2.5洗脫結(jié)合的抗體后，膠回收（用50mM NaOH洗滌，PBS沖洗后，保存在4度20%乙醇里）。

Q：所有蛋白樣品需要在4°C或冰上操作的原因？

A：避免蛋白變性

Q：在使用Protein A+G Sepharose Beads 時(shí)，怎么達(dá)到去除非特異性吸附的最佳效果？

A：可以通過(guò)更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，例如，針對(duì)單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度（0.2-0.5%）的SDS洗滌抗體-sepharose beads復(fù)合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。

Q：IP的實(shí)驗(yàn)步驟中，最后都沒有將兩個(gè)蛋白質(zhì)分開的步驟，難道是在前面的步驟中相結(jié)合的兩個(gè)蛋白質(zhì)自己已經(jīng)分開了嗎？

A：上樣時(shí)要加loading buffer，煮沸。這時(shí)所有蛋白都變性，自然就分開了。也有人先將蛋白洗下來(lái)再電泳

Q：經(jīng)?？吹降鞍踪|(zhì)免疫共沉淀后行westernblot,我想問(wèn)什么時(shí)候需要作免疫共沉淀？為什么不直接進(jìn)行westernblot 呢？

A：通常，免疫共沉淀，是檢測(cè)可溶性蛋白的步驟之一，而不是最終的方法。因?yàn)槌恋淼牡鞍?，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。而后續(xù)的步驟大凡使用免疫印跡的方法去完成。如果做質(zhì)譜分析，一般還要進(jìn)一步用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后回收。由于采用了免疫學(xué)的方法沉淀目的蛋白，使之蛋白的檢測(cè)帶有強(qiáng)烈的目的性。 免疫共沉淀純化蛋白的質(zhì)量，與抗體化珠子（Beads）的質(zhì)量和洗滌緩沖液的質(zhì)量及其洗滌的方法

Q：當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時(shí)，重鏈或者輕鏈分子的WB信號(hào)常常由于信號(hào)過(guò)強(qiáng)而導(dǎo)致影響對(duì)目的蛋白的WB結(jié)果判斷。這該如何避免？

A：針對(duì)上述情況，通常有二種解決辦法：
    1． 選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。
    2． 使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A+G beads交聯(lián)，然后通過(guò)添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-sepharose beads復(fù)合物，最后離心去除抗體-sepharose beads復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。

Q：能否做染色質(zhì)（染色體）免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

A：能

Q：是否BSA預(yù)封閉處理

A：pull-down實(shí)驗(yàn)，一般不推薦BSA封閉。一般在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)非特異吸附現(xiàn)象很嚴(yán)重是，才考慮加入BSA。

Q：是否針對(duì)任何實(shí)驗(yàn)，Protein A+G均可替代Protein A或Protein G？

A：是的

Q：A+G與A或G相比優(yōu)勢(shì)是？

A：protein a+g比protein a或protein g適合于免疫沉淀更多種類的抗體

Q：條帶淡可能原因？解決方法

A：1）最簡(jiǎn)單方法，增加實(shí)驗(yàn)樣品的量和濃度。每毫升ProteinAG可以吸附20mg以上抗體，一般pulldown實(shí)驗(yàn)，proteinAG都是過(guò)量的。
     2）延長(zhǎng)proteinAG和樣品的混合震蕩時(shí)間（例如4度過(guò)夜），保證proteinAG和樣品的充分接觸。

Q：sepharose對(duì)人或鼠lgG的親和力如何

A：人的親和力是1ml結(jié)合20mg以上 IgG，鼠大概3mg左右

Q：一次性收集的細(xì)胞，大約0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）

A： IP實(shí)驗(yàn)時(shí)候，推薦消化下來(lái)細(xì)胞后，直接用RIPA裂解液裂解。根據(jù)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)位置（細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核還是細(xì)胞器）可以選擇抽提細(xì)胞亞組分。選擇合適的強(qiáng)度的裂解液。蛋白酶抑制劑推薦用cocktail。

Q：是否需要將總蛋白用非免疫血清和Sepharose反應(yīng)，去除非特異性結(jié)合蛋白，再來(lái)加抗體，接著加Sepharose？

A： 推薦用用非免疫血清preclear樣品，降低非特異性產(chǎn)生的假陽(yáng)性。

Q：如果需要先處理非特異性結(jié)合蛋白，那么非免疫血清，就是陰性對(duì)照的抗體（正常鼠IgG）嗎？

A：是的。

Q：未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少

A：1、提高樣品量；2、降低buffer的離子強(qiáng)度。

Q：目的蛋白高背景

A：蛋白質(zhì)背景高1、首先確認(rèn)電泳體系、染色體系、WB體系沒有錯(cuò)誤；2、提高buffer的離子輕度；3、實(shí)驗(yàn)中增加preclear去掉非特異性吸附問(wèn)題。

Q：能否用高濃度的變性劑

A：不推薦使用高濃度的變性劑尤其是強(qiáng)變性劑，容易使蛋白質(zhì)變性造成實(shí)驗(yàn)失敗。

Q：如何使用對(duì)照抗體

A：對(duì)照抗體選擇同種未免疫的動(dòng)物提取的血清中純化的抗體，各種亞型都有商品化產(chǎn)品。

Q：能否幾種抗體共同使用

A：幾種抗體同時(shí)使用，可以但是不推薦。

Q：?jiǎn)慰寺】贵w的作用

A：?jiǎn)慰寺】贵w的優(yōu)點(diǎn)是特異性高。

Q:抗體的特異性有多重要

A:特異性高的抗體能夠有效的補(bǔ)貨目的蛋白質(zhì)同時(shí)降低背景。

Q:蛋白間的相互作用發(fā)生在哪里

A:蛋白質(zhì)的相互作用位點(diǎn)需要其他實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用，不得用于人體 / 動(dòng)物醫(yī)療、診斷及臨床治療