Q:cck-8是否可檢測(cè)懸浮細(xì)胞
A:可以
Q：96孔板每孔孵育多少個(gè)細(xì)胞
A：通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔約2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔約5000個(gè)細(xì)胞，具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定。
Q：說(shuō)明書(shū)推薦每孔2000個(gè)細(xì)胞，若我的是每孔10000個(gè)細(xì)胞，每孔加多少CCK8？
A：培養(yǎng)基和CCK-8比例10:1就可以
Q：96孔板，每孔中接種多少細(xì)胞懸液
A：100 ul /孔
Q：48孔板或24孔板是否可用
A：建議不用，48孔和24孔均不可上酶標(biāo)儀檢測(cè)。推薦常規(guī)96孔板
Q：96孔板每孔加入多少CCK-8溶液
A：每孔加入10ul 7Sea-CCK-8，如果起始的培養(yǎng)體積為200ul，則需加入20ul 7Sea-CCK-8，培養(yǎng)基和CCK-8比例10:1
Q：如何做空白對(duì)照
A：可以用加相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)基和7Sea-CCK-8但不加細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，若擔(dān)心所使用的藥物會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)置加相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和7Sea-CCK-8但不加細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。
Q：只加CCK-8不加細(xì)胞的空白孔，數(shù)值上增
A：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著時(shí)間的增加，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，請(qǐng)注意蒸發(fā)問(wèn)題。因?yàn)榉磻?yīng)環(huán)境溫度較高，會(huì)有部分液體揮發(fā)?？瞻捉M雖然沒(méi)有細(xì)胞，但是隨著液體的揮發(fā)，藥物濃度相當(dāng)于提高了，所以空白對(duì)照的數(shù)值也會(huì)有輕微的變化（但不會(huì)有明顯的變化）。如果很在意空白對(duì)照的數(shù)值，可將96 孔板外圍一圈加培養(yǎng)基、水或PBS 保濕。同時(shí)，可以把96 孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)靠近水盤(pán)的位置以緩解蒸發(fā)。將96孔板外圍兩圈用PBS鋪板，這樣揮發(fā)先揮發(fā)周邊的，可以對(duì)內(nèi)部及空白對(duì)照的影響降至最低。
Q：加入CCK8后孵育多久
A：在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，具體時(shí)間可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。
Q：一般多久測(cè)一次值
A：預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Q：如何測(cè)吸光值
A：用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值
Q:如果沒(méi)有450nm濾光片，可以選用其他的濾光片嗎
A:若無(wú)450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片
Q:如果樣品是高渾濁度的細(xì)胞懸液，可以使用多大的波長(zhǎng)測(cè)定
A:可以使用大于600nm的波長(zhǎng)，例如650nm，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。
Q:加入CCK8后暫時(shí)不測(cè)OD值，可以如何處理暫時(shí)保存？能夠保存多久？
A:如果需要暫時(shí)不測(cè)定O.D值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，避光保存在室溫，24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
Q:CCK8結(jié)果怎么處理？有計(jì)算細(xì)胞活力的公式嗎
A:扣除背景后的數(shù)值直接表示細(xì)胞活力，如果測(cè)藥物的IC50，須用origin等軟件做曲線(xiàn)擬合。
Q:如何制作CCK-8標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)？
A:cck8沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具體看實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。
Q:請(qǐng)問(wèn)CCK8測(cè)450nnM的OD值用什么時(shí)間點(diǎn)最好？做過(guò)1h，2.5h,4h的時(shí)間梯度，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)同一樣品其吸光值不一樣而且吸光值的變化趨勢(shì)也不一樣。那么OD值在多大的范圍時(shí)比較好呢？這樣好根據(jù)吸光值的范圍確定時(shí)間點(diǎn)。
A:OD值在0.3-0.7范圍內(nèi)做比較好
Q:如何保存
A:7Sea-Cell Counting Kit 溶液在避光、0-5℃的條件下可以保存1 年，若長(zhǎng)期不用可在-20℃下避光保存2 年。建議分裝后保存于-20℃，使用時(shí)提前于4℃解凍，請(qǐng)避免反復(fù)凍融，否則增加背景值，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
Q:需要準(zhǔn)備哪些設(shè)備及耗材
A:1. 10ul、100-200 ul 以及多通道移液器
2. 酶標(biāo)儀（帶有450 nm 濾光片）
3. 96 孔培養(yǎng)板
4. CO2 培養(yǎng)箱
Q:培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定
A:培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而不同。在正式實(shí)驗(yàn)前，建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索鋪板的細(xì)胞數(shù)量以及加入7Sea-Cell Counting Kit 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
Q:鋪板注意事項(xiàng)
A:鋪板時(shí)請(qǐng)注意保證每個(gè)孔細(xì)胞數(shù)量均勻，建議鋪板過(guò)程中注意時(shí)常混勻，防止因細(xì)胞沉淀造成不均勻。
Q:混勻
A:加入7Sea-Cell Counting Kit后請(qǐng)前后左右輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次，使培養(yǎng)基和7Sea-Cell Counting Kit 溶液充分混勻。
Q:是否需要更換培養(yǎng)基
A:不需要，若藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
Q:待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性該做何處理
A:本試劑盒的檢測(cè)依賴(lài)于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性，可在加7Sea-Cell Counting Kit 之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
可在加7Sea-CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。如果實(shí)驗(yàn)中有還原劑，請(qǐng)檢查背景的O.D值，即在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入CCK-8試劑在一定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，和不加藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行比較（只有CCK-8試劑），如果O.D值明顯偏高，則說(shuō)明有反應(yīng)。
Q:如果培養(yǎng)基顏色或PH已變化，是否需要更換新的培養(yǎng)基
A:加入7Sea-Cell Counting Kit時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。
Q:酶標(biāo)儀檢測(cè)前查看有無(wú)氣泡
A:用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。
Q:槍頭孔壁殘留誤差
A:用槍頭加樣后更換槍頭。加7Sea-Cell Counting Kit時(shí)可直接加入液面以下，加樣后，前后左右傾斜混合幾次，保證混合均勻
Q:適用細(xì)胞
A:因?yàn)闇y(cè)線(xiàn)粒體酶，所以真核細(xì)胞，有線(xiàn)粒體的均可，例如單細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞。但有細(xì)胞壁的細(xì)胞，例如植物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，底物進(jìn)入細(xì)胞效率低，不推薦。
Q:觀(guān)察天數(shù)
A:推薦1到2天
Q:吸光值過(guò)高
A:縮短加入試劑后的溫育時(shí)間
Q:參比波長(zhǎng)
A:實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，絕大多數(shù)情況下，參比波長(zhǎng)不是必須的，用空白對(duì)照作為零也可以。但是在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，或者培養(yǎng)有懸浮物，或有其他大顆粒藥物等情況下，可以通過(guò)參比波長(zhǎng)修正結(jié)果（每個(gè)孔里的干擾不一致，參比波長(zhǎng)可以起到修正的作用）
Q:重復(fù)性
A:完全同樣的情況下，測(cè)量讀數(shù)批間誤差小于1%
Q:線(xiàn)性不佳原因
A:細(xì)胞不均；培養(yǎng)液蒸發(fā)；還原劑；氣泡；孔板周?chē)蝗Σ荒苡?，除非只培養(yǎng)少于一天的時(shí)間；細(xì)胞數(shù)目很重要，太少信號(hào)會(huì)低
Q:分散性不好的培養(yǎng)液
A:前后左右來(lái)回傾斜96孔板，使試劑混合充分
Q:晶體析出
A:儲(chǔ)存時(shí)間太長(zhǎng)；溫度過(guò)低；之前使用后關(guān)閉不嚴(yán)或體積太?。ㄕ舭l(fā)），可能會(huì)過(guò)飽和產(chǎn)生析出現(xiàn)象（低于5%的小幾率事件）?？梢栽谑覝鼗旌险鹗?，以助溶解。
Q:金屬毒性
A:可以檢測(cè)金屬毒性，最好做空白對(duì)照
Q:OD值還可以，但數(shù)值跨度太大（波動(dòng)大）
A:數(shù)據(jù)跨度大須重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。
Q:CCK8與傳統(tǒng)的MTT方法相比有哪些優(yōu)勢(shì)
A:1. 7Sea-Cell Counting Kit是用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)等與細(xì)胞活性和增殖相關(guān)的實(shí)驗(yàn)的一種高靈敏度，無(wú)放射性的比色檢測(cè)法。
2. 7Sea-Cell Counting Kit對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可以多次測(cè)定選取最佳測(cè)定時(shí)間，與MTT 方法相比線(xiàn)性范圍更寬，靈敏度更高。
3. 7Sea-Cell Counting Kit溶液不需配制，可以直接加入到細(xì)胞樣品中，即開(kāi)即用，比MTT 更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測(cè)。
4. MTT 實(shí)驗(yàn)生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來(lái)的誤差。
Q:適用于那些細(xì)胞？其他還有哪些細(xì)胞可用？生物被膜內(nèi)的活菌（流感嗜血桿菌和綠膿桿菌）
A:所有哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，細(xì)菌一般沒(méi)有檢測(cè)CCK8的，可以染色法，或者流式，最常規(guī)的方法，有報(bào)道， 比濁法測(cè)OD600
Q:CCK-8是定性還是定量
A:定量
Q:樣本是不敏感的T淋巴細(xì)胞
A:1、細(xì)胞鋪板10萬(wàn)/well. 或者預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索一個(gè)比較合適的細(xì)胞濃度。
2、cck8不但與細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，還與細(xì)胞活力有關(guān)。所以T淋巴細(xì)胞雖然不增值，還是能檢測(cè)到細(xì)胞活力的，但是需要的細(xì)胞的數(shù)量需要的比較多。
3、如果藥物處理后直接加cck8檢測(cè)，確定藥物有沒(méi)有吸收背景。
4、實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，重新測(cè)一下細(xì)胞密度，確認(rèn)細(xì)胞數(shù)量。
Q:是否可以替代Brud或EDU法檢測(cè)細(xì)胞增殖
A:雖然CCK通過(guò)檢測(cè)對(duì)生長(zhǎng)期的細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的活性，而胸腺嘧啶插入法通過(guò)核苷酸類(lèi)似物的方式插入合成的DNA來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的活性，這幾種方法是有一定關(guān)聯(lián)性的，CCK可替換胸腺嘧啶插入法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖，并且檢測(cè)更方便
Q:懸浮細(xì)胞/貼壁細(xì)胞分別如何做實(shí)驗(yàn)
A:懸浮細(xì)胞注意別在換液時(shí)候丟失細(xì)胞即可。
Q:溶解后的甲臜是在培養(yǎng)液里還是在細(xì)胞內(nèi)
A:甲臢是在培養(yǎng)液中的
Q:如果OD值低，什么原因造成？可以采取什么辦法
A:OD偏低原因1、細(xì)胞活力低；2、細(xì)胞數(shù)量少，可以采取加大細(xì)胞數(shù)量或者延長(zhǎng)孵育時(shí)間（最高可以嘗試8小時(shí)）來(lái)解決
Q:設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？
A:參比波長(zhǎng)是為了降低細(xì)胞或者96孔板造成的誤差，可以不設(shè)
Q:CCK8試劑盒，在檢測(cè)的時(shí)候，血清和培養(yǎng)基里的酚紅對(duì)檢測(cè)結(jié)果有沒(méi)有影響
A:無(wú)影響，建議做空白對(duì)照
Q:空白孔數(shù)值偏高，有可能是培養(yǎng)基長(zhǎng)菌嗎？或者其他原因？
A:空白孔數(shù)值偏高一般認(rèn)為染菌造成的，很少出現(xiàn)這種問(wèn)題
Q:CCK8能檢測(cè)組織嗎
A:不能檢測(cè)組織
Q:不是很穩(wěn)定，重復(fù)孔，同樣的處理因素，結(jié)果差異有點(diǎn)大，原因？
A:重復(fù)孔不穩(wěn)定主要原因是細(xì)胞分配不均勻
Q:是否可以檢測(cè)T細(xì)胞
A:可以，T細(xì)胞長(zhǎng)的慢，需延長(zhǎng)孵育時(shí)間
Q:CCK 對(duì)照組0.5左右和樣品組0.3左右 OD值都不高
A:建議1、孵育時(shí)間增加一倍；2、細(xì)胞數(shù)量增加（預(yù)實(shí)驗(yàn)摸條件）
Q:當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)（骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，另一個(gè)是懸浮T細(xì)胞），培養(yǎng)一段時(shí)間后，只測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖情況，請(qǐng)問(wèn)用CCK-8能測(cè)嗎？怎么做？
A:通常測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，可以有兩種方法，
1） 對(duì)于懸浮細(xì)胞，不換液，直接在培養(yǎng)上清中，按照比例加入CCK-8, 培養(yǎng)一段時(shí)間即可，此時(shí)酚紅的干擾幾乎可以忽略不計(jì)，如果有不含細(xì)胞的孔，那么可以直接去除背景，所以問(wèn)題不大。
2）對(duì)于貼壁細(xì)胞，建議先把培養(yǎng)基和CCK-8按照比例混合，然后換液培養(yǎng)，這樣做的目的是，降低孔間加樣的差異。
對(duì)于這兩種細(xì)胞的情況，
1）如果測(cè)定貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，那么可以把懸浮的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移掉，使用上述第二種方法測(cè)定。
2）如果T細(xì)胞對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)很關(guān)鍵，不能取走，那么測(cè)定的活性程度是總量，此時(shí)，需要對(duì)每一個(gè)孔的T細(xì)胞進(jìn)行估算，如果每個(gè)培養(yǎng)條件下T細(xì)胞總量接近，或者T細(xì)胞含量很少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于間充質(zhì)細(xì)胞，也可以測(cè)定，使用對(duì)照孔可以去除T細(xì)胞的影響。
3）如果T細(xì)胞可以短時(shí)間內(nèi)除去，可以找個(gè)靈敏度高的CCK-8，信號(hào)強(qiáng)，建議細(xì)胞量合適的情況下（每一個(gè)孔10000個(gè)），30分鐘左右出讀數(shù)結(jié)果，測(cè)定后，可以將T細(xì)胞再加入培養(yǎng)孔。 這樣做對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。但是如果做動(dòng)力學(xué)，那么要考慮的因素多一些。
Q:耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞用CCK結(jié)果無(wú)差異，是什么原因?qū)е?/span>
A:耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞結(jié)果無(wú)差異是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的問(wèn)題。選擇合適的藥物濃度或者直接測(cè)藥物對(duì)耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞的IC50
Q:應(yīng)用范圍
A:生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性測(cè)定等
Q:7Sea-Cell Counting Kit是通過(guò)和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶反應(yīng)而反映著細(xì)胞數(shù)量，假如細(xì)胞已經(jīng)死亡，而脫氫酶活性還有，那么如何計(jì)算細(xì)胞數(shù)量？
A:多數(shù)情況下，細(xì)胞死亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的成分會(huì)降解，脫氫酶會(huì)有部分釋放，但是活性和活細(xì)胞比，比較低。舉例說(shuō)：１００個(gè)細(xì)胞死亡２０小時(shí)后，釋放的脫氫酶活力，不足５個(gè)活細(xì)胞的脫氫酶活力，也就是說(shuō)，這種情況帶來(lái)的誤差５％以?xún)?nèi)。而且，這種細(xì)胞死亡，對(duì)同種細(xì)胞來(lái)說(shuō)，情況是一樣的，一般都是在不同的孔間比較同種細(xì)胞，所以系統(tǒng)誤差是一樣的，即系統(tǒng)誤差會(huì)彼此消減
Q:試劑盒中有高濃度的1Methoxy PMS的存在，那么毒性怎樣
A:無(wú)須擔(dān)心，ＰＭＳ等化學(xué)物質(zhì)很穩(wěn)定，沒(méi)有揮發(fā)性；高純的的產(chǎn)品，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是沒(méi)有影響的，而且一般測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)都在生物安全柜中進(jìn)行，對(duì)人體而且非常安全。
Q:若每次測(cè)定的數(shù)值不同是什么原因？如何解決？
A:原則上， 7Sea-Cell Counting Kit在不同試驗(yàn)中都可以精確反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。如果不同試驗(yàn)產(chǎn)生偏差，可能是培養(yǎng)基的量、試劑的量有偏差，如果細(xì)胞數(shù)量一樣，讀數(shù)應(yīng)該是一致的。不過(guò)，測(cè)量的讀數(shù)不一致，不重要，重要的是線(xiàn)性，換句話(huà)說(shuō)，如果兩次試驗(yàn)同樣細(xì)胞數(shù)量讀數(shù)有差異，那么這種差異對(duì)每個(gè)孔都是一致的，細(xì)胞數(shù)量5000的讀數(shù)降低了10%，那么細(xì)胞數(shù)量10000的也會(huì)降低10%。
建議：每次試驗(yàn)設(shè)定內(nèi)參（陽(yáng)性，陰性和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)），只要標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性是一致的，就可以對(duì)測(cè)量的數(shù)值放心。
Q:如何避免某些物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響?
A:1）設(shè)定陰性對(duì)照，每個(gè)孔的本底干擾都減去，保證減去本底后，讀數(shù)都是細(xì)胞造成的。
2）做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，預(yù)先知道在可能的干擾物質(zhì)存在情況下，影響有多大。
Q:Cell Counting Kit做藥物刺激兩個(gè)周的實(shí)驗(yàn)怎么做？
A:首先要保證兩周時(shí)間，細(xì)胞數(shù)量不會(huì)超過(guò)3萬(wàn)/孔； 先做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，確定線(xiàn)性范圍； 設(shè)置實(shí)驗(yàn)時(shí)，要有陰性對(duì)照(無(wú)藥物）； 每個(gè)顯色的時(shí)間點(diǎn)要統(tǒng)一（比如都是加入CCK8后2小時(shí)讀數(shù)）； 建議每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都要重復(fù)3個(gè)孔以上。
本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)使用，不用于臨床診斷、治療及其他非科研用途。
