Q:檢測原理

A:細胞在發(fā)生凋亡時，會在生理生化和細胞形態(tài)上發(fā)生一系列變化，在凋亡中晚期，激活的DNA內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，DNA會被降解成為約180bp-200bp 的片段，而正?；蛘咴鲋臣毎苌侔l(fā)生DNA斷裂。利用這個差異，用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT 酶）把FITC標記的dUTP標記到斷裂DNA片段的3’-OH 末端，然后進行熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測，這個方法被稱為TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法細胞凋亡檢測。

Q:檢測方法

A:熒光顯微鏡或流式細胞儀

Q:樣本類型

A:石蠟包埋組織切片、組織冰凍切片、細胞涂片以及細胞懸液

Q:儲存條件

A:試劑盒需儲存在-20℃非無霜冰箱中，避免反復凍融

Q:固定樣品需要準備什么

A:固定樣品，需自備多聚甲醛

Q:固定懸浮細胞

A:懸浮細胞可用以下方法固定或貼附在玻片上：4°C 緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除細胞培養(yǎng)上清，并將細胞重新懸浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。按照上述方法離心收集細胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細胞密度重懸。固定后的細胞可以保存在4°C。固定后的細胞（100-300μl）可直接固定在玻片上，使用聚L-賴氨酸包被的玻片可以提高細胞的黏附性

一、石蠟包埋組織切片處理流程

Q:如何徹底洗脫石蠟

A:室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5 分鐘以徹底脫掉石蠟。

Q:乙醇浸泡

A:室溫下用100%乙醇浸泡切片5 分鐘，更換新的100%乙醇再浸泡5 分鐘

Q:給樣本增加水分

A:室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1 次，每次2分鐘，逐漸增加水分

Q:乙醇浸洗后如何處理

A:用PBS 輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。

Q:蛋白酶K如何配置

A:用PBS溶液配置終濃度為20μg/ml的蛋白酶K

Q:蛋白酶K是否可含Dnase活性

A:不可

Q:每個樣本需要多少蛋白酶K

A:每個樣本需要100μL 蛋白酶K 溶液

Q:加入蛋白酶K后孵育多久

A:每個樣本上滴加100μL 濃度為20μg/ml 的蛋白酶K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20 分鐘

Q:孵育時間太長會有何影響

A:嚴格控制孵育時間，孵育時間過長可對細胞造成一定的傷害

Q:孵育時間過短會有何影響

A:嚴格控制孵育時間，孵育時間過短可能造成透性處理不充分，影響標記效率。

Q:蛋白酶K工作液的條件是否都一樣

A:蛋白酶K工作液的使用濃度、處理時間及溫度因組織或細胞的類型或固定方法的不同而有所不同，使用者可參照試劑盒提供的標準使用說明摸索最合適的實驗條件

Q:蛋白酶K作用后如何處理

A:用PBS 溶液潤洗樣本三次

Q:如何配置標記反應液

A:

組分比例	1個樣品	10個樣品	20個樣品
FITC-標記反應混合物	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	2 uL	20 uL	40 uL
標記反應液	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:標記反應液用不完能否儲存

A:標記反應液應充分混勻，并且一次用完，不能儲存，所以應該酌量配置。

Q:標記前需不需要再處理

A:洗滌樣品一次，輕輕吸干樣本周圍的緩沖液，注意不要觸碰到樣本

Q:每個樣本加入多少TdT標記反應混合物

A:在每個樣本上立即滴加50μl 上述準備的TdT 標記反應混合物

Q:巧用封口膜

A:用預先裁剪好的比樣本稍大的Parafilm?封口膜覆蓋樣本。
注意：可將封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不僅可以確保反應混合物的均勻分布，也能減少孵育過程中的液體蒸發(fā)。

Q:標記反應的孵育條件

A:避光，將切片置于濕盒中于37℃孵育60-90 分鐘。

Q:標記反應完成后如何終止

A:移走Parafilm?封口膜，并將切片置于PBS 溶液中室溫孵育1 分鐘

Q:如何降低背景

A:為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton? X-100和 2mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分鐘，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈

Q:PI的使用量

A:滴加50uL PI染色液，在黑暗中室溫放置5分鐘

Q:PI孵育后如何洗滌樣本

A:洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘。重復兩次，總共洗三次

Q:檢測前需處理

A:滴干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細胞周邊的區(qū)域

Q:如何在熒光顯微鏡下檢測

A:立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標準的熒光過濾裝置在520 ± 20nm的熒光下觀察綠色熒光，在>600nm下觀察PI的紅色熒光。

Q:載玻片可以放置多久

A:如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜。

Q:FITC綠色熒光作用對象

A:PI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-dUTP摻入而定位的綠色熒光

Q:結果評斷

A:統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)并計算出細胞凋亡率。

Q:熒光顯微鏡檢測結果分析

A: 1、PI 濾光片可以用來觀察檢測樣本中的全體細胞，所有細胞都呈現(xiàn)紅色熒光，F(xiàn)ITC濾光片觀察樣本，發(fā)出明亮綠色熒光信號的細胞為凋亡細胞，而暗淡或沒有綠色熒光發(fā)出的區(qū)域則為未凋亡細胞或非凋亡晚期細胞。非凋亡細胞由于缺乏大量的3’-OH 末端，因此不會被顯著摻入和標記熒光素基團。
    2、由于凋亡細胞中含有3’-OH 末端的DNA 片段主要集中在細胞核及凋亡小體中，因此可以利用形態(tài)學分析結合熒光信號來解釋TUNEL法的凋亡檢測的結果。凋亡過程中典型的形態(tài)學改變已經(jīng)被明確確定和廣泛接受，可以用來作為細胞程序化死亡的檢測指標，并輔助說明TUNEL 檢測的實驗結果。在組織切片樣本中，很難觀察到胞膜的突起或起泡，許多凋亡細胞的胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形，保存完好的凋亡小體有時可以觀察到。由于凋亡是一個非同步發(fā)生的過程，組織中的凋亡細胞可能呈散在分布而非像壞死細胞一樣呈連續(xù)或成群地分布。

二、組織冰凍切片處理流程

Q:操作流程與石蠟包埋組織切片的有何不同之處

A:該操作流程與石蠟包埋組織切片相似，除了將脫蠟步驟替換為固定和短暫的水化步驟，并將蛋白酶K 的處理時間縮短到10 分鐘。在進行該實驗檢測前需固定冰凍組織。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進行清洗。
注意：在操作中避免樣本干燥?。?！

Q:組織固定與水化

A:1、將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室溫孵育15 分鐘。
   2、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
   3、將玻片浸沒在PBS 溶液中，室溫孵育15 分鐘。
   4、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。這時可用疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。

Q:組織冰凍切片樣本的通透性

A:增加樣本通透性并將蛋白酶K 的處理時間縮短到10 分鐘，其他同于石蠟包埋組織切片的處理

Q:固定細胞片處理流程

A:該操作流程與冰凍組織切片相似，除了將蛋白酶K 的處理時間縮短到5 分鐘。將懸浮細胞固定到玻片上的操作請參考“注意事項”章節(jié)。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進行清洗。注意：在操作中避免樣本干燥

三、流式細胞術檢測細胞懸液處理流程

Q:流式細胞術檢測，細胞如何固定

A:1、4°C 緩慢離心（2000rpm）5 分鐘，去除培養(yǎng)上清，PBS 洗滌一次，重新離心收集細胞。
   2、用新鮮配置4%多聚甲醛（in PBS）固定細胞，使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動的同時進行固定，離心收集細胞。按照上述方法PBS重懸洗滌一次，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細胞密度重懸。

Q:固定后的細胞保存條件

A:固定后的細胞可以保存在4°C，可以穩(wěn)定保存2-6 個月。

Q:流式細胞術檢測，如何水化

A:1、將1ml 固定細胞（1×106 cells/ml）轉移到干凈的離心管中。
   2、室溫緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除乙醇溶液上清。
   3、將細胞重懸在200μl PBS 溶液中。
   4、室溫緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除PBS 溶液，重復一次。

Q:流式細胞術檢測，如何增加細胞通透性

A:用含0.1％ Triton X-100和0.2%BSA的PBS重懸細胞，室溫孵育5-10分鐘。

Q:流式細胞術檢測，如何設立陽性對照

A:1、DNaseⅠ溶液配置：3000U/ml或者1mg/ml in PBS, 1mM MgSO4 and 1mg/ml BSA
2、取經(jīng)過預處理（已完成固定和通透性處理）的細胞，用DNaseⅠ處理，室溫孵育10 分鐘。

Q:流式細胞術檢測，如何設立陰性對照

A:在配置E中的標記反應液時，不加TdT酶。

Q:流式細胞術檢測，配置標記反應液

A:

組分比例	陰性對照	1個樣品	10個樣品	20個樣品
FITC-標記反應混合物	48uL	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	0	2 uL	20 uL	40 uL
標記反應液	加水至50uL	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:流式細胞術檢測，如何標記反應

A:1、PBS洗滌樣品一次。
   2、在每個樣本加入50μl 上述準備的TdT 標記反應混合物，重懸樣品。
   3、避光，將樣品放置于37℃孵育60 分鐘。

Q:流式細胞術檢測，終止與結果評斷

A:1、反應完成后，用200uLPBS洗滌1次。
   2、滴加50uL PI染色液，在黑暗中室溫放置5分鐘。
   3、離心，用200uLPBS洗滌樣本，總共洗三次。
   4、立即用流式細胞儀分析樣本。

Q:流式細胞儀如何檢測

A:1、用裝備有488nm 氬離子激發(fā)光源的流式細胞儀檢測標記后的細胞懸液，發(fā)射波長是517nm（FITC）和580（PI）?？梢栽O定FITC-PI雙染的細胞和PI單染的細胞比值作為凋亡細胞的比率。
   2、流式細胞儀檢測中光散射參數(shù)的改變同樣可以用來監(jiān)測和判斷細胞凋亡情況的發(fā)生。例如，未處理的懸浮細胞大多有很高的前向散射值，但誘導出現(xiàn)凋亡后，由于細胞皺縮和膜起泡，側向散射將大大增強。結合光散射參數(shù)的改變及TUNEL 標記實驗的檢測結果，往往可以確定或互相印證用單個方法得到的結論。

Q:實驗過程中，有事暫停實驗，試劑盒能否暫時放在冰上

A:試劑盒使用后盡快放回-20℃冰箱保存

Q:TdT酶需注意的溫度條件

A:TdT 酶在-20℃保存時不會凝固，不需要提前取出融化，只需在使用前迅速從-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存

Q:FITC儲存條件

A:FITC-12-dUTP標記混合液對光敏感，避光儲存于–20℃，在標記時，孵育緩沖液或者包含標記混合物的載玻片要避免光照

Q:是否需要準備其他試劑或溶液

A:如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯

Q:FITC-標記反應混合物作用

A:FITC-標記反應混合物（FITC-LABELING REACTION MIX）：FITC-dUTP和未標記的dNTP以最佳的比例混合，在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（TdT 酶）的作用下標記DNA 3’-OH 末端

Q:TdT酶作用

A:TdT 酶（TdT ENZYME）：將標記和未標記的脫氧核糖核苷酸摻入斷裂的DNA 3’-OH 末端

Q:PI染色液作用

A:PI染色液：含PI核染料，通過染色所有細胞的細胞核DNA，從而觀察樣本中的全體細胞

Q:非特異性熒光，有些細胞或組織， 核酸或者聚合酶活性水平較高，導致出現(xiàn)非特異性的熒光標記

A:取細胞或組織后立即固定，以阻止這些酶導致假陽性。

Q:非特異性熒光， TUNEL反應時間過長，或細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光

A:注意控制反應時間，并確保樣品濕潤。

Q:熒光背景很高，支原體污染。

A:請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

Q:熒光背景很高，高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA斷裂，產(chǎn)生較多3’-OH 末端

A:凋亡晚期檢測，同時減少TUNEL反應時間，以提高信噪比。

Q:熒光背景很高，TUNEL反應過強

A:減少TdT的用量至標準量的20-50%。

Q:標記效率低，樣品固定時間過長，導致交聯(lián)程度過高

A:適當減少固定時間

Q:標記效率低， 熒光易淬滅，F(xiàn)ITC 在普通光照 10 分鐘就會嚴重淬滅

A:避光操作

Q:熒光弱是什么原因導致？如何解決？

A:熒光弱第一原因是通透不夠（調(diào)整蛋白酶K或者Triton孵育條件，第二原因才是熒光淬滅（注意避光）

Q:石蠟切片樣本中加入蛋白酶K的作用是什么？

A:石蠟樣品（包括冰凍切片）是組織樣品，蛋白酶K的作用是增加通透性，使DNA暴漏

Q:流式細胞術檢測細胞懸液處理流程。是否包含細胞涂片或貼壁細胞樣本？

A:流式方法檢測適合細胞樣品，可以適用于懸浮細胞或者貼壁細胞消化成懸浮細胞。貼壁細胞或者懸浮細胞固定到玻片上也可以用于熒光顯微鏡檢測

Q:乙醇的作用是什么？梯度乙醇浸洗的目的？

A:石蠟切片用二甲苯脫蠟后，乙醇洗去掉二甲苯，乙醇和水互溶，再用乙醇梯度替換到水中，梯度替換是為了防止切片脫水太劇烈造成脫片或者切片變形

Q:洗滌樣品用什么洗滌？

A:洗滌樣品非特殊說明都用PBS

Q:石蠟切片和冰凍切片樣本最后標記反應，我們需要孵育60-90分鐘，有文獻顯示為60分鐘，90min是否時間太長？

A:孵育反應時間60-90min沒問題。我們也可以直接60min即可

Q:說明書中陽性、陰性對照的介紹是在細胞懸液流程中有描述，是否適用所有樣本

A:組織切片也可以用DNAseI做陽性對照和不加反應混合物的硬性對照

Q:熒光法與DAB顯色法相比是否有熒光易淬滅的問題

A:熒光染料都存在淬滅問題，注意避光

Q:Tunel 法檢測凋亡，背景非常高

A:1、可能是Tunel反應過強或時間過長---嘗試減少TdT酶的用量，控制反應時間；
   2、細胞或組織表面要確保濕潤；
   3、樣品包埋或者固定過程中，方法不當易造成DNA斷裂----改變包埋固定方法；
   4、有可能POD非特異結合----用3% BSA的PBS封閉樣品，室溫10分鐘，或者POD溶液稀釋2-3倍后使用；
   5、內(nèi)源性POD液可能會影響背景---在樣品通透處理前，用3%H202的甲醇浸泡樣品10分鐘。

Q:巧用封口膜

A:在標記反應中，推薦使用蓋片或封口膜覆蓋樣本，保證反應液均勻分布，并避免孵育過程中緩沖液蒸發(fā)損失。準備覆蓋膜時，可剪下一片Parafilm?封口膜，使其稍大于樣本，并將一角折起便于在接下來實驗步驟中取放

Q:濕盒的作用

A:用塑料或玻璃容器及紙巾自制濕盒，在樣本處理過程中使用濕盒保持樣本環(huán)境的濕潤，一定避免樣本干燥

Q:上流式細胞儀的是否主要針對的是細胞樣本？上熒光顯微鏡的主要是組織樣本？

A:流式只能檢測細胞樣品，顯微鏡可以檢測細胞樣品也可以檢測組織樣品

Q:1次是指一張片子/一個樣本的意思嗎

A:是的，一個反應即為一張片子或者50uL細胞懸液

Q:1次反應是指什么

A:1 次反應檢測2–5×10?個細胞的凋亡情況

Q:如何判斷一次反應所需的細胞數(shù)量

A:1、用測細胞數(shù)量的儀器（儀器較貴10w+）
   2、取1個樣品，用血細胞計數(shù)板數(shù)數(shù)量
   3、常做實驗者心里會有數(shù)，在大體范圍內(nèi)就行

Q:用DAPI替換PI染色組織切片樣本的，區(qū)別及優(yōu)缺點？DAPI若自備，配方？觀察條件？

A:DAPI和PI染核原理一樣，DAPI綠色適合tunel（紅色熒光染料），PI紅色適合tunel（綠色熒光染料如FITC）

Q:切片較厚，是否時間要加長？一般加長到多久合適？

A:蛋白酶K反應時間一般在10~30 min，具體孵育時間與樣本類型、切片薄厚等有關，一般我們實驗時，4um的片子反應10 min，但幾十um的可適當延長時間，如30 min，最終還是要摸索最佳時間。時間過長易脫片、過短起不到通透效果

本產(chǎn)品僅供科研實驗使用，不用于臨床診斷、治療及其他非科研用途。