Q:檢測原理

A:細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會在生理生化和細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生一系列變化，在凋亡中晚期，激活的DNA內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，DNA會被降解成為約180bp-200bp 的片段，而正常或者增殖細(xì)胞很少發(fā)生DNA斷裂。利用這個(gè)差異，用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT 酶）把Biotin標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂DNA片段的3’-OH 末端，用POD檢測標(biāo)記并用底物顯色，然后進(jìn)行顯微鏡觀察

Q:檢測方法

A:顯微鏡

Q:樣本類型

A:石蠟包埋組織切片、組織冰凍切片、細(xì)胞涂片以及貼壁細(xì)胞

Q:儲存條件

A:試劑盒需儲存在-20℃非無霜冰箱中，避免反復(fù)凍融。建議分裝保存Biotin-標(biāo)記反應(yīng)混合物

Q:自備試劑

A:1.石蠟切片自備試劑：PBS溶液、二甲苯；
      濃度梯度分別為70%、80%、90%、100%的乙醇溶液；
      每個(gè)樣本需要100μL 20μg/mL的蛋白酶K溶液，用PBS配制；
      含0.1% Triton X-100和2mg/mL BSA的PBS溶液；
      含3%BSA的PBS溶液（選用步驟）。
  2.組織冰凍切片自備試劑：PBS溶液；
      含4%多聚甲醛的PBS；
      每個(gè)樣本需要100μL 20μg/mL的蛋白酶K溶液，用PBS配制；
      含0.1% Triton X-100和2mg/mL BSA的PBS溶液；
      含3%BSA的PBS溶液（選用步驟）。
  3.固定細(xì)胞片自備試劑：與冰凍組織切片同。

Q:固定樣品需要準(zhǔn)備什么

A:固定樣品，需自備多聚甲醛

Q:Tunel反應(yīng)液配制后用不完可以保存繼續(xù)使用嗎

A:TUNEL反應(yīng)液即用即配，不要配制好后存放

Q:POD反應(yīng)液配制后如何保存

A:POD反應(yīng)液用POD貯液和POD稀釋液即用即配，配制好后可以4℃保存（3個(gè)月），POD可以-20℃保存

Q:我需要檢測石蠟切片，是否需要預(yù)處理

A：如果用于石蠟切片的檢測，需用蛋白酶K，二甲苯處理

Q：如何固定懸浮細(xì)胞

A：懸浮細(xì)胞可用以下方法固定或貼附在玻片上：4°C 緩慢離心（1000rpm）5分鐘，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并將細(xì)胞重新懸浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。按照上述方法離心收集細(xì)胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細(xì)胞密度重懸。固定后的細(xì)胞可以保存在4°C。固定后的細(xì)胞（100-300μl）可直接固定在玻片上，使用聚L-賴氨酸包被的玻片可以提高細(xì)胞的黏附性

一、石蠟包埋組織切片處理流程

Q:樣本如何脫蠟

A:1、室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5分鐘以徹底脫掉石蠟。
   2、室溫下用100%乙醇浸泡切片5分鐘，更換新的100%乙醇再浸泡5分鐘。
   3、室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1 次，每次2分鐘，逐漸增加水分。
   4、用PBS 輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。
   注意：在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤

Q:如何增加樣本的通透性

A:1、用PBS溶液配置終濃度為20μg/ml的蛋白酶K（不含DNase活性），每個(gè)樣本需要100μL 蛋白酶K 溶液。
   2、每個(gè)樣本上滴加100μL 濃度為20μg/ml 的蛋白酶K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20分鐘。
   3、用PBS 溶液潤洗樣本三次。
   4、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

Q:孵育時(shí)間沒有把握好，有沒有影響

A:注意：嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，孵育時(shí)間過長可對細(xì)胞造成一定的傷害，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。蛋白酶K工作液的使用濃度、處理時(shí)間及溫度因組織或細(xì)胞的類型或固定方法的不同而有所不同，使用者可參照試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)使用說明摸索最合適的實(shí)驗(yàn)條件。

Q:如何配置標(biāo)記反應(yīng)液

A:

Q:標(biāo)記反應(yīng)液用不完能否儲存

A:標(biāo)記反應(yīng)液應(yīng)充分混勻，并且一次用完，不能儲存，所以應(yīng)該酌量配置。

Q:標(biāo)記反應(yīng)

A:1、洗滌樣品一次，輕輕吸干樣本周圍的緩沖液，注意不要觸碰到樣本。
   2、在每個(gè)樣本上立即滴加50μl上述準(zhǔn)備的TdT 標(biāo)記反應(yīng)混合物。
   3、用預(yù)先裁剪好的比樣本稍大的Parafilm?封口膜覆蓋樣本。
   注意：可將封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不僅可以確保反應(yīng)混合物的均勻分布，也能減少孵育過程中的液體蒸發(fā)。
   4、將切片置于濕盒中于37℃孵育60-90分鐘。

Q:顯色與結(jié)果評斷

A:1、移走Parafilm?封口膜，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育1分鐘。
   2、輕輕去掉多余液體，換用新鮮的PBS 溶液室溫孵育1分鐘。
   3、用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。
   注意：為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton? X-100和 2mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分鐘，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。
   4、洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘。重復(fù)兩次，總共洗三次。
   可選：用3%BSA PBS封閉樣品，室溫放置20分鐘。
   5、滴干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細(xì)胞周邊的區(qū)域。
   6、用POD稀釋液，配制POD溶液（1:25-50稀釋），在每個(gè)樣本上滴加50uL POD溶液，37℃放置30分鐘。
   7、DAB顯色液A和B混合用PBS稀釋成1X工作液。PBS洗滌載玻片3次后，加入50-100uL DAB底物或者其他POD底物，室溫放置10分鐘。
   8、PBS洗滌載玻片3次，除去多余底物后，顯微鏡下分析樣本。

二、組織冰凍切片處理流程

Q:操作流程與石蠟包埋組織切片的有何不同之處

A:該操作流程與石蠟包埋組織切片相似，除了將脫蠟步驟替換為固定和短暫的水化步驟，并將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到10 分鐘。在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)檢測前需固定冰凍組織。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進(jìn)行清洗。
   注意：在操作中避免樣本干燥?。?！

Q:組織固定與水化

A:1、將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室溫孵育15 分鐘。
   2、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
   3、將玻片浸沒在PBS 溶液中，室溫孵育15 分鐘。
   4、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。這時(shí)可用疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。

Q:增加樣本通透性

A:將蛋白酶K的處理時(shí)間縮短到10分鐘，其他步驟同于石蠟包埋組織切片處理流程

Q:固定細(xì)胞片處理流程

A:該操作流程與冰凍組織切片相似，除了將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到5分鐘。將懸浮細(xì)胞固定到玻片上的操作請參考“注意事項(xiàng)”章節(jié)。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3次進(jìn)行清洗。注意：在操作中避免樣本干燥

Q:設(shè)立陽性對照

A:1、DNaseⅠ溶液配置：3000U/ml或者1mg/ml in PBS, 1mM MgSO4 and 1mg/ml BSA
   2、取經(jīng)過預(yù)處理（已完成固定和通透性處理）的細(xì)胞，用DNaseⅠ處理，室溫孵育10分鐘

Q:設(shè)立陰性對照

A:在配置E中的標(biāo)記反應(yīng)液時(shí)，不加TdT酶

Q:試劑盒組分Biotin-標(biāo)記反應(yīng)混合物（Biotin-LABELING REACTION MIX）的作用

A:Biotin-dUTP和未標(biāo)記的dNTP以最佳的比例混合，在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT 酶）的作用下標(biāo)記DNA 3’-OH 末端

Q:試劑盒組分TdT （TdT ENZYME）的作用

A:將標(biāo)記和未標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸摻入斷裂的DNA 3’-OH 末端

Q:試劑盒組分POD （25x）的作用

A:SA-HRP,用于結(jié)合Biotin-DNA,并通過HRP催化底物顯色

Q:試劑盒組分POD稀釋液的作用

A:用于稀釋POD

Q:試劑盒組分蛋白酶K濃度

A:1mg/ml

Q:非特異性染色，有些細(xì)胞或組織，核酸或者聚合酶活性水平較高，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性光標(biāo)記

A:取細(xì)胞或組織后立即固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性，或者用ddUTP和dATP封閉樣品

Q:非特異性染色，樣品包埋或者固定過程中，由于試劑原因或者方法不當(dāng)，造成DNA斷裂

A:更換試劑或者改變包埋固定方法

Q:非特異性染色，TUNEL反應(yīng)時(shí)間過長，或細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性染色

A:注意控制反應(yīng)時(shí)間，或者減少TdT用量（標(biāo)準(zhǔn)量的20-50%），并始終確保樣品濕潤

Q:非特異性染色，內(nèi)源性POD液可能會影響背景

A:在樣品通透處理前，用3%H2O2的甲醇浸泡樣品10分鐘

Q:非特異性染色，POD非特異結(jié)合

A:用3% BSA的PBS封閉樣品，室溫10分鐘，或者POD溶液比標(biāo)準(zhǔn)量稀釋2-3倍后使用

Q:背景很高，支原體污染

A:請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染

Q:背景很高，高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂，產(chǎn)生較多3’-OH 末端

A:凋亡晚期檢測，同時(shí)減少TUNEL反應(yīng)時(shí)間，以提高信噪比

Q:背景很高，TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)

A:減少TdT的用量至標(biāo)準(zhǔn)量的20-50%

Q:標(biāo)記效率低，樣品固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高

A:適當(dāng)減少固定時(shí)間，或者采用2%多聚甲醛溶液（溶于PBS）

Q:標(biāo)記效率低，組織樣品通透不足

A:延長孵育時(shí)間，或者提高孵育溫度，嘗試0.1M檸檬酸鈉60℃處理30分鐘

Q:什么是通透性？增加通透性的作用？

A:通透性是破壞細(xì)胞或者組織完整結(jié)構(gòu)，使DNA暴漏。

Q:石蠟樣品中，需添加蛋白酶K，蛋白酶K的作用？

A:蛋白酶K在組織樣品通透處理中作用非常關(guān)鍵

Q:POD稀釋液1:25-50稀釋，對于稀釋比例有無建議？

A:初次實(shí)驗(yàn)可以直接1:25稀釋

Q:如何看陽性/陰性對照的結(jié)果？

A:陰性對照為無任何染色，陽性對照為可見大量點(diǎn)狀沉淀

Q:用DAB顯色后會有什么結(jié)果？

A:DAB顯色后會有點(diǎn)狀褐色沉淀

Q:DAB自備是否有什么要求？

A:常規(guī)DAB顯色液即可

Q:DAB顯色背景高

A:DAB顯色沒有過強(qiáng)或者過弱之說，可能出現(xiàn)情況是背景高，背景高的原因是POD濃度過高或者POD反應(yīng)之后洗片子不充分

Q:所用儀器顯微鏡為光學(xué)顯微鏡，沒做過Tunel實(shí)驗(yàn)，不知是選擇FITC還是POD

A:根據(jù)所用儀器選擇，如果是熒光顯微鏡建議用FITC的好。另外流式細(xì)胞儀也用FITC，光學(xué)顯微鏡用POD

Q:Tunel （POD）做冰凍切片，固定時(shí)間較長，70度0.5h的抗原修復(fù)但是假陽性太多，是否需要進(jìn)行修復(fù)？一抗是否可4°過夜？

A:TUNEL的原理是dUTP與斷裂的DNA上的3‘OH結(jié)合，不需要做抗原修復(fù)；第一次TUNEL反應(yīng)只需37度反應(yīng)1h，或者延長時(shí)間即可。

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