Q:檢測原理

A:細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)在生理生化和細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生一系列變化，在凋亡中晚期，激活的DNA內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，DNA會(huì)被降解成為約180bp-200bp 的片段，而正?；蛘咴鲋臣?xì)胞很少發(fā)生DNA斷裂。利用這個(gè)差異，用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT 酶）把FITC標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂DNA片段的3’-OH 末端，然后進(jìn)行熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測，這個(gè)方法被稱為TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法細(xì)胞凋亡檢測。

Q:檢測方法

A:熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀

Q:樣本類型

A:石蠟包埋組織切片、組織冰凍切片、細(xì)胞涂片以及細(xì)胞懸液

Q:儲(chǔ)存條件

A:試劑盒需儲(chǔ)存在-20℃非無霜冰箱中，避免反復(fù)凍融

Q:固定樣品需要準(zhǔn)備什么

A:固定樣品，需自備多聚甲醛

Q:固定懸浮細(xì)胞

A:懸浮細(xì)胞可用以下方法固定或貼附在玻片上：4°C 緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并將細(xì)胞重新懸浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。按照上述方法離心收集細(xì)胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細(xì)胞密度重懸。固定后的細(xì)胞可以保存在4°C。固定后的細(xì)胞（100-300μl）可直接固定在玻片上，使用聚L-賴氨酸包被的玻片可以提高細(xì)胞的黏附性

一、石蠟包埋組織切片處理流程

Q:如何徹底洗脫石蠟

A:室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5 分鐘以徹底脫掉石蠟。

Q:乙醇浸泡

A:室溫下用100%乙醇浸泡切片5 分鐘，更換新的100%乙醇再浸泡5 分鐘

Q:給樣本增加水分

A:室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1 次，每次2分鐘，逐漸增加水分

Q:乙醇浸洗后如何處理

A:用PBS 輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。

Q:蛋白酶K如何配置

A:用PBS溶液配置終濃度為20μg/ml的蛋白酶K

Q:蛋白酶K是否可含Dnase活性

A:不可

Q:每個(gè)樣本需要多少蛋白酶K

A:每個(gè)樣本需要100μL 蛋白酶K 溶液

Q:加入蛋白酶K后孵育多久

A:每個(gè)樣本上滴加100μL 濃度為20μg/ml 的蛋白酶K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20 分鐘

Q:孵育時(shí)間太長會(huì)有何影響

A:嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，孵育時(shí)間過長可對(duì)細(xì)胞造成一定的傷害

Q:孵育時(shí)間過短會(huì)有何影響

A:嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，孵育時(shí)間過短可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。

Q:蛋白酶K工作液的條件是否都一樣

A:蛋白酶K工作液的使用濃度、處理時(shí)間及溫度因組織或細(xì)胞的類型或固定方法的不同而有所不同，使用者可參照試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)使用說明摸索最合適的實(shí)驗(yàn)條件

Q:蛋白酶K作用后如何處理

A:用PBS 溶液潤洗樣本三次

Q:如何配置標(biāo)記反應(yīng)液

A:

組分比例	1個(gè)樣品	10個(gè)樣品	20個(gè)樣品
FITC-標(biāo)記反應(yīng)混合物	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	2 uL	20 uL	40 uL
標(biāo)記反應(yīng)液	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:標(biāo)記反應(yīng)液用不完能否儲(chǔ)存

A:標(biāo)記反應(yīng)液應(yīng)充分混勻，并且一次用完，不能儲(chǔ)存，所以應(yīng)該酌量配置。

Q:標(biāo)記前需不需要再處理

A:洗滌樣品一次，輕輕吸干樣本周圍的緩沖液，注意不要觸碰到樣本

Q:每個(gè)樣本加入多少TdT標(biāo)記反應(yīng)混合物

A:在每個(gè)樣本上立即滴加50μl 上述準(zhǔn)備的TdT 標(biāo)記反應(yīng)混合物

Q:巧用封口膜

A:用預(yù)先裁剪好的比樣本稍大的Parafilm?封口膜覆蓋樣本。
注意：可將封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不僅可以確保反應(yīng)混合物的均勻分布，也能減少孵育過程中的液體蒸發(fā)。

Q:標(biāo)記反應(yīng)的孵育條件

A:避光，將切片置于濕盒中于37℃孵育60-90 分鐘。

Q:標(biāo)記反應(yīng)完成后如何終止

A:移走Parafilm?封口膜，并將切片置于PBS 溶液中室溫孵育1 分鐘

Q:如何降低背景

A:為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton? X-100和 2mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分鐘，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈

Q:PI的使用量

A:滴加50uL PI染色液，在黑暗中室溫放置5分鐘

Q:PI孵育后如何洗滌樣本

A:洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘。重復(fù)兩次，總共洗三次

Q:檢測前需處理

A:滴干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細(xì)胞周邊的區(qū)域

Q:如何在熒光顯微鏡下檢測

A:立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾裝置在520 ± 20nm的熒光下觀察綠色熒光，在>600nm下觀察PI的紅色熒光。

Q:載玻片可以放置多久

A:如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜。

Q:FITC綠色熒光作用對(duì)象

A:PI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-dUTP摻入而定位的綠色熒光

Q:結(jié)果評(píng)斷

A:統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)并計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。

Q:熒光顯微鏡檢測結(jié)果分析

A: 1、PI 濾光片可以用來觀察檢測樣本中的全體細(xì)胞，所有細(xì)胞都呈現(xiàn)紅色熒光，F(xiàn)ITC濾光片觀察樣本，發(fā)出明亮綠色熒光信號(hào)的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，而暗淡或沒有綠色熒光發(fā)出的區(qū)域則為未凋亡細(xì)胞或非凋亡晚期細(xì)胞。非凋亡細(xì)胞由于缺乏大量的3’-OH 末端，因此不會(huì)被顯著摻入和標(biāo)記熒光素基團(tuán)。
    2、由于凋亡細(xì)胞中含有3’-OH 末端的DNA 片段主要集中在細(xì)胞核及凋亡小體中，因此可以利用形態(tài)學(xué)分析結(jié)合熒光信號(hào)來解釋TUNEL法的凋亡檢測的結(jié)果。凋亡過程中典型的形態(tài)學(xué)改變已經(jīng)被明確確定和廣泛接受，可以用來作為細(xì)胞程序化死亡的檢測指標(biāo)，并輔助說明TUNEL 檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在組織切片樣本中，很難觀察到胞膜的突起或起泡，許多凋亡細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形，保存完好的凋亡小體有時(shí)可以觀察到。由于凋亡是一個(gè)非同步發(fā)生的過程，組織中的凋亡細(xì)胞可能呈散在分布而非像壞死細(xì)胞一樣呈連續(xù)或成群地分布。

二、組織冰凍切片處理流程

Q:操作流程與石蠟包埋組織切片的有何不同之處

A:該操作流程與石蠟包埋組織切片相似，除了將脫蠟步驟替換為固定和短暫的水化步驟，并將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到10 分鐘。在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)檢測前需固定冰凍組織。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進(jìn)行清洗。
注意：在操作中避免樣本干燥?。。?

Q:組織固定與水化

A:1、將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室溫孵育15 分鐘。
   2、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
   3、將玻片浸沒在PBS 溶液中，室溫孵育15 分鐘。
   4、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。這時(shí)可用疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。

Q:組織冰凍切片樣本的通透性

A:增加樣本通透性并將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到10 分鐘，其他同于石蠟包埋組織切片的處理

Q:固定細(xì)胞片處理流程

A:該操作流程與冰凍組織切片相似，除了將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到5 分鐘。將懸浮細(xì)胞固定到玻片上的操作請(qǐng)參考“注意事項(xiàng)”章節(jié)。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進(jìn)行清洗。注意：在操作中避免樣本干燥

三、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞懸液處理流程

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，細(xì)胞如何固定

A:1、4°C 緩慢離心（2000rpm）5 分鐘，去除培養(yǎng)上清，PBS 洗滌一次，重新離心收集細(xì)胞。
   2、用新鮮配置4%多聚甲醛（in PBS）固定細(xì)胞，使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行固定，離心收集細(xì)胞。按照上述方法PBS重懸洗滌一次，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細(xì)胞密度重懸。

Q:固定后的細(xì)胞保存條件

A:固定后的細(xì)胞可以保存在4°C，可以穩(wěn)定保存2-6 個(gè)月。

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，如何水化

A:1、將1ml 固定細(xì)胞（1×106 cells/ml）轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。
   2、室溫緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除乙醇溶液上清。
   3、將細(xì)胞重懸在200μl PBS 溶液中。
   4、室溫緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除PBS 溶液，重復(fù)一次。

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，如何增加細(xì)胞通透性

A:用含0.1％ Triton X-100和0.2%BSA的PBS重懸細(xì)胞，室溫孵育5-10分鐘。

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，如何設(shè)立陽性對(duì)照

A:1、DNaseⅠ溶液配置：3000U/ml或者1mg/ml in PBS, 1mM MgSO4 and 1mg/ml BSA
2、取經(jīng)過預(yù)處理（已完成固定和通透性處理）的細(xì)胞，用DNaseⅠ處理，室溫孵育10 分鐘。

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，如何設(shè)立陰性對(duì)照

A:在配置E中的標(biāo)記反應(yīng)液時(shí)，不加TdT酶。

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，配置標(biāo)記反應(yīng)液

A:

組分比例	陰性對(duì)照	1個(gè)樣品	10個(gè)樣品	20個(gè)樣品
FITC-標(biāo)記反應(yīng)混合物	48uL	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	0	2 uL	20 uL	40 uL
標(biāo)記反應(yīng)液	加水至50uL	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，如何標(biāo)記反應(yīng)

A:1、PBS洗滌樣品一次。
   2、在每個(gè)樣本加入50μl 上述準(zhǔn)備的TdT 標(biāo)記反應(yīng)混合物，重懸樣品。
   3、避光，將樣品放置于37℃孵育60 分鐘。

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測，終止與結(jié)果評(píng)斷

A:1、反應(yīng)完成后，用200uLPBS洗滌1次。
   2、滴加50uL PI染色液，在黑暗中室溫放置5分鐘。
   3、離心，用200uLPBS洗滌樣本，總共洗三次。
   4、立即用流式細(xì)胞儀分析樣本。

Q:流式細(xì)胞儀如何檢測

A:1、用裝備有488nm 氬離子激發(fā)光源的流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記后的細(xì)胞懸液，發(fā)射波長是517nm（FITC）和580（PI）?？梢栽O(shè)定FITC-PI雙染的細(xì)胞和PI單染的細(xì)胞比值作為凋亡細(xì)胞的比率。
   2、流式細(xì)胞儀檢測中光散射參數(shù)的改變同樣可以用來監(jiān)測和判斷細(xì)胞凋亡情況的發(fā)生。例如，未處理的懸浮細(xì)胞大多有很高的前向散射值，但誘導(dǎo)出現(xiàn)凋亡后，由于細(xì)胞皺縮和膜起泡，側(cè)向散射將大大增強(qiáng)。結(jié)合光散射參數(shù)的改變及TUNEL 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果，往往可以確定或互相印證用單個(gè)方法得到的結(jié)論。

Q:實(shí)驗(yàn)過程中，有事暫停實(shí)驗(yàn)，試劑盒能否暫時(shí)放在冰上

A:試劑盒使用后盡快放回-20℃冰箱保存

Q:TdT酶需注意的溫度條件

A:TdT 酶在-20℃保存時(shí)不會(huì)凝固，不需要提前取出融化，只需在使用前迅速從-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存

Q:FITC儲(chǔ)存條件

A:FITC-12-dUTP標(biāo)記混合液對(duì)光敏感，避光儲(chǔ)存于–20℃，在標(biāo)記時(shí)，孵育緩沖液或者包含標(biāo)記混合物的載玻片要避免光照

Q:是否需要準(zhǔn)備其他試劑或溶液

A:如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯

Q:FITC-標(biāo)記反應(yīng)混合物作用

A:FITC-標(biāo)記反應(yīng)混合物（FITC-LABELING REACTION MIX）：FITC-dUTP和未標(biāo)記的dNTP以最佳的比例混合，在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT 酶）的作用下標(biāo)記DNA 3’-OH 末端

Q:TdT酶作用

A:TdT 酶（TdT ENZYME）：將標(biāo)記和未標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸摻入斷裂的DNA 3’-OH 末端

Q:PI染色液作用

A:PI染色液：含PI核染料，通過染色所有細(xì)胞的細(xì)胞核DNA，從而觀察樣本中的全體細(xì)胞

Q:非特異性熒光，有些細(xì)胞或組織， 核酸或者聚合酶活性水平較高，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記

A:取細(xì)胞或組織后立即固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。

Q:非特異性熒光， TUNEL反應(yīng)時(shí)間過長，或細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光

A:注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保樣品濕潤。

Q:熒光背景很高，支原體污染。

A:請(qǐng)使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

Q:熒光背景很高，高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂，產(chǎn)生較多3’-OH 末端

A:凋亡晚期檢測，同時(shí)減少TUNEL反應(yīng)時(shí)間，以提高信噪比。

Q:熒光背景很高，TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)

A:減少TdT的用量至標(biāo)準(zhǔn)量的20-50%。

Q:標(biāo)記效率低，樣品固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高

A:適當(dāng)減少固定時(shí)間

Q:標(biāo)記效率低， 熒光易淬滅，F(xiàn)ITC 在普通光照 10 分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅

A:避光操作

Q:熒光弱是什么原因?qū)е?？如何解決？

A:熒光弱第一原因是通透不夠（調(diào)整蛋白酶K或者Triton孵育條件，第二原因才是熒光淬滅（注意避光）

Q:石蠟切片樣本中加入蛋白酶K的作用是什么？

A:石蠟樣品（包括冰凍切片）是組織樣品，蛋白酶K的作用是增加通透性，使DNA暴漏

Q:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞懸液處理流程。是否包含細(xì)胞涂片或貼壁細(xì)胞樣本？

A:流式方法檢測適合細(xì)胞樣品，可以適用于懸浮細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞消化成懸浮細(xì)胞。貼壁細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞固定到玻片上也可以用于熒光顯微鏡檢測

Q:乙醇的作用是什么？梯度乙醇浸洗的目的？

A:石蠟切片用二甲苯脫蠟后，乙醇洗去掉二甲苯，乙醇和水互溶，再用乙醇梯度替換到水中，梯度替換是為了防止切片脫水太劇烈造成脫片或者切片變形

Q:洗滌樣品用什么洗滌？

A:洗滌樣品非特殊說明都用PBS

Q:石蠟切片和冰凍切片樣本最后標(biāo)記反應(yīng)，我們需要孵育60-90分鐘，有文獻(xiàn)顯示為60分鐘，90min是否時(shí)間太長？

A:孵育反應(yīng)時(shí)間60-90min沒問題。我們也可以直接60min即可

Q:說明書中陽性、陰性對(duì)照的介紹是在細(xì)胞懸液流程中有描述，是否適用所有樣本

A:組織切片也可以用DNAseI做陽性對(duì)照和不加反應(yīng)混合物的硬性對(duì)照

Q:熒光法與DAB顯色法相比是否有熒光易淬滅的問題

A:熒光染料都存在淬滅問題，注意避光

Q:Tunel 法檢測凋亡，背景非常高

A:1、可能是Tunel反應(yīng)過強(qiáng)或時(shí)間過長---嘗試減少TdT酶的用量，控制反應(yīng)時(shí)間；
   2、細(xì)胞或組織表面要確保濕潤；
   3、樣品包埋或者固定過程中，方法不當(dāng)易造成DNA斷裂----改變包埋固定方法；
   4、有可能POD非特異結(jié)合----用3% BSA的PBS封閉樣品，室溫10分鐘，或者POD溶液稀釋2-3倍后使用；
   5、內(nèi)源性POD液可能會(huì)影響背景---在樣品通透處理前，用3%H202的甲醇浸泡樣品10分鐘。

Q:巧用封口膜

A:在標(biāo)記反應(yīng)中，推薦使用蓋片或封口膜覆蓋樣本，保證反應(yīng)液均勻分布，并避免孵育過程中緩沖液蒸發(fā)損失。準(zhǔn)備覆蓋膜時(shí)，可剪下一片Parafilm?封口膜，使其稍大于樣本，并將一角折起便于在接下來實(shí)驗(yàn)步驟中取放

Q:濕盒的作用

A:用塑料或玻璃容器及紙巾自制濕盒，在樣本處理過程中使用濕盒保持樣本環(huán)境的濕潤，一定避免樣本干燥

Q:上流式細(xì)胞儀的是否主要針對(duì)的是細(xì)胞樣本？上熒光顯微鏡的主要是組織樣本？

A:流式只能檢測細(xì)胞樣品，顯微鏡可以檢測細(xì)胞樣品也可以檢測組織樣品

Q:1次是指一張片子/一個(gè)樣本的意思嗎

A:是的，一個(gè)反應(yīng)即為一張片子或者50uL細(xì)胞懸液

Q:1次反應(yīng)是指什么

A:1 次反應(yīng)檢測2–5×10?個(gè)細(xì)胞的凋亡情況

Q:如何判斷一次反應(yīng)所需的細(xì)胞數(shù)量

A:1、用測細(xì)胞數(shù)量的儀器（儀器較貴10w+）
   2、取1個(gè)樣品，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板數(shù)數(shù)量
   3、常做實(shí)驗(yàn)者心里會(huì)有數(shù)，在大體范圍內(nèi)就行

Q:用DAPI替換PI染色組織切片樣本的，區(qū)別及優(yōu)缺點(diǎn)？DAPI若自備，配方？觀察條件？

A:DAPI和PI染核原理一樣，DAPI綠色適合tunel（紅色熒光染料），PI紅色適合tunel（綠色熒光染料如FITC）

Q:切片較厚，是否時(shí)間要加長？一般加長到多久合適？

A:蛋白酶K反應(yīng)時(shí)間一般在10~30 min，具體孵育時(shí)間與樣本類型、切片薄厚等有關(guān)，一般我們實(shí)驗(yàn)時(shí)，4um的片子反應(yīng)10 min，但幾十um的可適當(dāng)延長時(shí)間，如30 min，最終還是要摸索最佳時(shí)間。時(shí)間過長易脫片、過短起不到通透效果

本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)使用，不用于臨床診斷、治療及其他非科研用途。