Q:一管式RT-PCR與傳統(tǒng)兩步法區(qū)別

A:7Sea-One Tube RT-PCR（一管式RT-PCR）區(qū)別于傳統(tǒng)的兩步法（逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分兩步完成），RNA模板逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增在一個(gè)管內(nèi)完成，大大降低了污染風(fēng)險(xiǎn)、縮短了分析時(shí)間并且提高了反應(yīng)的重復(fù)性。

Q:擴(kuò)增產(chǎn)物可以做哪些實(shí)驗(yàn)

A:產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色進(jìn)行分析，進(jìn)行下游的常規(guī)操作，例如限制性酶切、連接、DNA測(cè)序、dHPLC分析；或者采用定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行在線分析。

Q:試劑盒可以應(yīng)用哪些領(lǐng)域

A:1、cDNA克隆（平端連接、限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳/EB染色、熒光毛細(xì)管電泳、DNA測(cè)序等）；2、特別適合RNA的qRT-PCR分析；3、RNA病毒或者RNA樣品的定量分析

Q:保真性如何

A:DNA 聚合酶選用熱啟動(dòng) KOD，具有高保真擴(kuò)增特性，產(chǎn)物適用于平端連接。（產(chǎn)物適合平端連接）

Q:反應(yīng)體系

A:以10ul體系為例，在微量離心管中加入以下各種成分

Q:滅菌

A:實(shí)驗(yàn)中盡可能使用一次性的滅菌塑料制品，玻璃容器應(yīng)用0.1% DEPC在37℃處理過(guò)夜，并且高壓滅菌處理，所有的水應(yīng)該用0.1% DEPC 37℃處理過(guò)夜并滅菌

Q:引物用量

A:建議引物用量為終濃度0.2-0.6uM

Q:初次實(shí)驗(yàn)，如何設(shè)置RNA模板梯度

A:例如100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.02ng總RNA

Q:陽(yáng)性對(duì)照

A:建議每組反應(yīng)用內(nèi)參基因做陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控

Q:反應(yīng)為陰性

A:dNTP容易失效，反應(yīng)為陰性時(shí)，建議另外添加0.4mM dNTP

Q:Rnase inhibitor

A:RI可以有效防止RNA降解，并大大提高反應(yīng)的重復(fù)性，建議加入終濃度0.5-1U/ul的RI，特別是微量RNA樣本分析，加入RI的效果非常明顯

Q:PCR反應(yīng)循環(huán)示例

A:典型的一步法RT-PCR，包括第一階段的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序設(shè)置和第二階段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，例如（該例子為擴(kuò)增400bp片段）

Q:長(zhǎng)片段

A:擴(kuò)增長(zhǎng)片段可適當(dāng)延長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間（15-25min）和DNA延伸時(shí)間（1kb/min）

Q:延伸溫度

A:延伸溫度可以設(shè)定為52-72℃間，選用68℃延伸溫度，可以較好發(fā)揮KOD活性

Q:擴(kuò)增低豐度模板

A:建議用45個(gè)循環(huán)

本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)使用，不用于臨床診斷、治療或病原檢測(cè)。